HFHG45基因对血液与血管标志基因表达的影响

发布时间：2017-07-27 09:07

  本文关键词：HFHG45基因对血液与血管标志基因表达的影响

  更多相关文章： 斑马鱼 HFHG45 血细胞 整体胚胎原位杂交

【摘要】：哺乳动物生命周期较长,其基因完全敲除经常导致胚胎死亡,不利于对心血管系统的研究和观察。斑马鱼体形小,可以通过渗透作用提供氧气和营养,即使心血管有严重的缺陷也能存活一段时间。其胚胎发育时期透明,方便检测和观察,斑马鱼的心脏发育过程在进化上和人类具有高度的保守性,所以是学者们认可的研究心脏和心血管发育的理想的模式生物之一。本实验室前期发现HFHG45调控血液与血管的发育。本文利用模式生物斑马鱼进一步研究HFHG45基因对造血系统发育的影响。据报道,心脑血管发病人数居我国重大疾病之首,而且是我国死亡率最多的疾病。人类很多疾病的发生和发展都与血管或血液发育有着非常紧密和不可分割的联系。脊椎动物中血管与血液都是起源于同一种细胞,即血液的祖细胞。血祖细胞最早起源于中胚层,继而分化形成血管祖细胞和血液祖细胞。由血祖细胞分化而来的早期血细胞主要参与前期的造血,由血液祖细胞分化而来的造血干细胞调控定向造血,分化为成熟的髓系细胞、红细胞以及淋巴细胞。血管祖细胞开始分化为血管内皮(EC)细胞,之后分化为动脉、静脉和淋巴血管等。血液与血管的发育过程是在复杂而有序的分子信号网络的调控下进行的,其出现异常会导致严重的发育缺陷或疾病。目前,调控造血体系与血管体系发育的分子机制还未研究清楚,探究血液与血管发育过程中的重要分子有助于完善血液与血管发育过程的分子信号网络,对心脏和心血管病的治疗提供新的个性化治疗手段和方法。本论文通过斑马鱼模型探索HFHG45对于血管发育和造血干细胞分化的影响。本实验室前期已建立稳定的HFHG45敲除品系。本文利用标志分子探针检测不同类型的血细胞,造血干细胞和血管标志基因在HFHG45完全敲除品系中的表达情况。主要以Notch信号,shh信号等重要信号通路的相关标志基因进行检测。主要检测的标志基因如下:shh和myod1(体节细胞标志基因),dld和dlc(notch信号配体),pax7a(肌生节细胞标志基因),pax2a和cdh17(前肾标志基因),amhc(心脏标志基因),scl和etv2(造血干细胞标志基因)。结果表明,在斑马鱼中敲除HFHG45明显下调了shh,scl,dld,dlc,pax7a,pax2a,cdh17,amhc,etv2和myod1的表达。综上所述,HFHG45可能通过Notch信号和shh信号调控血细胞分化和血管发育,但其对心脏,包括心房以及心室的影响并不明显。
【关键词】：斑马鱼 HFHG45 血细胞 整体胚胎原位杂交
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1 引言和文献综述11-23
• 1.1 模式生物斑马鱼11-12
• 1.2 模式生物斑马鱼的造血过程12-14
• 1.2.1 斑马鱼得原始造血12-13
• 1.2.2 斑马鱼的定向造血13-14
• 1.3 模式生物斑马鱼的血管发育过程14-15
• 1.4 斑马鱼造血中涉及到重要调节基因和信号通路15-18
• 1.4.1 影响斑马鱼造血重要的标记基因15
• 1.4.2 调控斑马鱼造血过程的信号通路15-18
• 1.5 斑马鱼的发育时期特征18
• 1.6 整体胚胎原位杂交技术18-19
• 1.7 本文的前期研究基础19-21
• 1.8 本文的研究意义21-23
• 2 材料和方法23-37
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 实验动物23
• 2.1.2 菌种及载体、主要试剂、试剂盒23-24
• 2.1.3 主要试剂的配置24
• 2.1.4 主要实验仪器和耗材24-25
• 2.2 方法25-37
• 2.2.1 斑马鱼的生长环境的控制、饲养以及配种25-26
• 2.2.2 常规的分子克隆方法26-31
• 2.2.3 斑马鱼整体胚胎原位杂交31-34
• 2.2.4 WESTERN BLOTTING34-35
• 2.2.5 CRISPR/CAS9实验方法35-37
• 3 实验结果和分析37-51
• 3.1 整体胚胎原位杂交探针的合成37-45
• 3.1.1 DCL, DLD等血液发育相关标志基因探针的合成37-39
• 3.1.2 血液发育相关标志基因GATA2, SCL, TRIM45, FLK1, HAND2等探针的合成39-44
• 3.1.3 RNA探针的制备44-45
• 3.2 HFHG45在斑马鱼造血中的作用45-51
• 3.2.1 通过WISH检测CDH17表达情况45-46
• 3.2.2 通过WISH检测TAL1表达情况46-47
• 3.2.3 通过WISH检测ESTRP表达情况47-48
• 3.2.4 通过WISH检测DLD, DLC表达情况48-49
• 3.2.5 通过WISH检测SHH表达情况49
• 3.2.6 通过WISH检测PAX7A表达情况49-50
• 3.2.7 WISH样品基因型鉴定情况50-51
• 4 讨论51-53
• 5 结语53-54
• 6 其他工作54-58
• 6.1 构建PMCS1-IRES-EGFP载体54
• 6.2 利用CRISPR/CAS9系统构建斑马鱼POP1/POP2敲除品系54-57
• 6.2.1 目的序列分析和打靶位点设计54
• 6.2.2 打靶GRNA设计54-57
• 6.3 HFHG45抗体的特异性检测57-58
• 参考文献58-62
• 中英文缩写词简表62-63
• 攻读学位期间的学术论文63-64
• 致谢64-65

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