芦笋雌雄花发育转录组分析及性别决定相关miRNA靶基因的鉴定

发布时间：2017-07-29 05:04

  本文关键词：芦笋雌雄花发育转录组分析及性别决定相关miRNA靶基因的鉴定

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【摘要】：植物性别决定是指雌、雄性器官产生差异并分离到不同个体形成具有单一性别特征个体的过程,性别决定模式具有不稳定性和遗传多样性的特点。在植物性别决定过程中,植物性染色体及其所承载的性别决定基因起主导作用,而microRNA(miRNA)可以通过调控性别决定基因的表达来影响植物的性别决定,此外,环境因素以及植物激素等外在和内在因素也会影响植物的性别表达。目前,涉及植物性别表达中基因调控网络的研究较少。芦笋(Asparagus officinalis L.)是一种在世界范围内广泛种植的重要保健型蔬菜,其作为典型的雌雄异株植物,性染色体处于植物性染色体进化的早期,是研究植物性染色体进化和两性植物起源的理想材料,也是研究植物性别决定与性别分化的重要模式植物。本论文以芦笋不同发育时期的雄花和雌花为材料,在形态和细胞学观察的基础上,利用RNA-seq技术比较了雄花和雌花在性别分化前后的转录组差异,鉴定了参与芦笋性别决定与雌、雄花分化相关的重要基因和miRNA靶基因,并利用分子和生理生化技术证实了植物激素和糖类代谢参与调控芦笋性别决定过程。研究结果为深入揭示植物性别决定系统调控的分子机理提供了重要的理论基础,同时对于人为控制植物性型表现、选育全雄系芦笋品种、提高芦笋产量与品质等方面具有重要的实践意义。主要研究结果如下：(1)以芦笋品种‘'Grande"为材料,利用体视显微镜与扫描电镜(SEM)比较了雄花和雌花的发育过程,明确了芦笋从两性花原基转变为单性花的关键时期,表明在花蕾长度达2.0 mm时,雄花和雌花开始出现明显的形态差异。进一步运用RNA-seq技术对芦笋性别决定前、中、后三个代表时期,即0.5 mm、2.0mm和4.0 mm长度的雌、雄花(蕾)进行了转录组测序分析,组装了一个拥有93,658个Unigene的数据库。雌、雄花之间有4,130个基因存在显著的表达差异,并且差异表达基因(DEGs)主要集中在后两个时期,即雌、雄花之间呈现明显形态学差异的时期。根据对DEGs的表达模式分析,进一步筛选到了17个性别偏向表达且与花器官发育相关的重要基因,其中参与雄蕊和雌蕊发育的转录因子可能参与调控芦笋的性别决定。通过分析花发育过程中基因的表达变化,发现4个基因随着雄花的发育在中后期表达水平显著升高,而它们在雌花中表达水平下降,暗示着它们可能对雄性器官的形态建成具有重要作用。此外,我们在芦笋雌、雄花之间鉴定了390个SNP,分布于343个Unigene,这些分子标记对于芦笋的全雄育种以及遗传图谱的构建具有一定意义。(2)利用GO富集分析以及pathway分析,对芦笋雌、雄花之间的DEGs进行功能分类。结果表明,64个基因涉及到植物激素和糖类的生物合成与降解,暗示着植物激素和糖类可能参与调控芦笋的性别决定与雌、雄花发育。从中筛选出了29个参与植物激素和糖类代谢的关键酶基因,通过分析它们在雌、雄花之间的表达模式,并利用qRT-PCR验证,发现葡萄糖、蔗糖和淀粉代谢相关基因的表达水平在雌、雄花发育过程中发生显著变化；赤霉素、细胞分裂素,以及油菜素内酯的合成酶基因具有雄花偏向性,而生长素和茉莉酸的合成酶基因具有雌花偏向性。为进一步探究内源激素在芦笋雌、雄花中的分布模式,我们利用高效液相色谱串联质谱法和酶联免疫吸附法测定了不同发育时期芦笋雌、雄花中赤霉素、生长素和茉莉酸的含量,结果表明,赤霉素在雄花中含量较高,而生长素和茉莉酸在雌花中含量较高,表明一些重要的代谢酶基因的表达水平变化影响植物内源激素的积累,进而调控芦笋的性别决定与雌、雄花的分化。(3)利用转录组测序构建的Unigene数据库,运用生物信息学的方法对鉴定的芦笋雌雄株之间差异表达的miRNA进行靶基因预测,共预测得到了27个miRNA的206个潜在靶基因,它们大多是对植物生长发育起重要调控作用的转录因子,且有24个预测的靶基因在芦笋雄花和雌花之间差异表达,暗示着它们很可能参与了芦笋雌、雄花分化。运用RLM-5'RACE法对其中4个miRNA的10个靶基因进行验证,发现miRNA可以诱导其靶基因发生剪切作用,表明靶基因预测的准确度较高。为了筛选出与芦笋性别分化相关的miRNA及其靶基因,我们进一步对雌、雄个体中差异表达的miRNA及其靶基因在不同发育时期雌、雄花中进行qRT-PCR分析,发现miR160d在雌花中上调表达并负调控生长素响应因子(ARFs),而miR396f在雄花发育中期上调表达并负调控生长调节因子(GRFs),暗示着这两个miRNA很可能参与调控芦笋的性别决定与雌、雄花分化,且miR160d通过对生长素的信号传导途径的调控行使其功能。
【关键词】：芦笋 性别决定 雌花 雄花 转录组 差异表达基因 miRNA 激素
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S644.6
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略词表12-15
• 前言15-17
• 1 文献综述17-37
• 1.1 植物性染色体进化研究进展17-20
• 1.1.1 植物性染色体的起源17-18
• 1.1.2 植物性染色体的演变18-19
• 1.1.3 遗传退化与剂量补偿效应19-20
• 1.2 植物性别决定基因研究进展20-23
• 1.2.1 植物性染色体连锁基因的挖掘20-22
• 1.2.2 植物性别决定基因的分离与鉴定22-23
• 1.3 miRNA参与调控植物性别决定与分化23-26
• 1.3.1 植物miRNA的形成与作用机制23-24
• 1.3.2 植物性别决定与分化相关的miRNA24-26
• 1.4 激素与糖信号参与调控植物性别决定与分化26-29
• 1.4.1 植物激素调控性别决定与分化26-28
• 1.4.2 糖类代谢与植物性别分化28-29
• 1.5 芦笋性别决定机制研究进展29-32
• 1.5.1 芦笋雌雄花分化及其生理生化特性的研究29-30
• 1.5.2 芦笋性别决定基因及其连锁分子标记的鉴定30-32
• 1.6 转录组学研究概况32-37
• 1.6.1 转录组测序技术32-33
• 1.6.2 转录组学研究的应用33-37
• 2 芦笋不同发育时期雌雄花形态学特征研究及转录组测序分析37-57
• 2.1 材料与方法38-44
• 2.1.1 植物材料38
• 2.1.2 主要试剂与仪器38-39
• 2.1.3 花器官的形态观察与比较39-40
• 2.1.4 转录组的高通量测序40-42
• 2.1.5 基因功能注释42-43
• 2.1.6 差异表达基因筛选43
• 2.1.7 SNP的鉴定43-44
• 2.2 结果与分析44-53
• 2.2.1 芦笋雌雄花发育的形态学特征与测序样品的选择44-46
• 2.2.2 RNA-seq数据分析46-50
• 2.2.3 芦笋雌雄花间差异表达基因分析50-52
• 2.2.4 芦笋花发育不同时期间差异表达基因分析52-53
• 2.2.5 芦笋雄花与雌花间SNP的鉴定53
• 2.3 讨论53-57
• 2.3.1 芦笋性别分化过程中两性花向单性花的转变53-54
• 2.3.2 芦笋雌雄花发育过程中基因表达模式分析54
• 2.3.3 基于表达特征预测芦笋性别决定相关基因54-57
• 3 芦笋雌雄花不同发育时期差异表达基因的功能分析与验证57-79
• 3.1 材料与方法59-63
• 3.1.1 植物材料59
• 3.1.2 主要试剂与仪器59
• 3.1.3 差异表达基因的GO功能分类59
• 3.1.4 差异表达基因的代谢通路预测59-60
• 3.1.5 特定代谢途径相关基因的筛选60
• 3.1.6 qRT-PCR验证基因表达特征60-62
• 3.1.7 植物内源激素含量的测定62-63
• 3.2 结果与分析63-76
• 3.2.1 芦笋雌雄花间差异表达基因的GO功能富集分析63-68
• 3.2.2 芦笋雌雄花间差异表达基因的Pathway富集分析68-69
• 3.2.3 植物激素代谢相关基因的表达特征69-70
• 3.2.4 糖类代谢相关基因的表达特征70-71
• 3.2.5 基因表达模式的qRT-PCR验证71-75
• 3.2.6 芦笋雌雄花不同发育时期内源生长素、赤霉素和茉莉酸的含量变化75-76
• 3.3 讨论76-79
• 3.3.1 植物激素调控芦笋性别决定与性别分化76-78
• 3.3.2 糖信号参与调控芦笋性别分化78-79
• 4 基于芦笋转录组数据对性别分化相关miRNA靶基因的鉴定与表达分析79-97
• 4.1 材料与方法81-87
• 4.1.1 植物材料81
• 4.1.2 主要试剂与仪器81
• 4.1.3 运用生物信息学方法预测miRNA靶基因81-82
• 4.1.4 运用RLM-5'RACE法验证miRNA靶基因82-86
• 4.1.5 miRNA及其靶基因的qRT-PCR分析86-87
• 4.2 结果与分析87-92
• 4.2.1 利用转录组数据库预测芦笋雌雄株差异表达miRNA的靶基因87-88
• 4.2.2 运用RLM-5'RACE法验证得到芦笋4个miRNA的10个靶基因88-89
• 4.2.3 芦笋雌雄花发育不同时期miRNA及其靶基因的表达模式分析89-92
• 4.3 讨论92-97
• 4.3.1 芦笋雌雄个体差异表达miRNA的靶基因预测与验证92-93
• 4.3.2 芦笋性别分化相关miRNA及其靶基因的筛选与鉴定93-94
• 4.3.3 miR160d调控芦笋性别分化的模式浅析94-97
• 5 结论97-99
• 参考文献99-109
• 附录109-135

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本文编号：587527