转IRT1基因龙葵毛状根体系的建立及其对镉胁迫响应的初步探讨

发布时间：2017-07-31 16:26

  本文关键词：转IRT1基因龙葵毛状根体系的建立及其对镉胁迫响应的初步探讨

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【摘要】：目的：自然界中存在能够富集镉(Cd)的超富集植物,这种植物可以通过新陈代谢机制摄取和固定环境中的Cd,从而在一定限度的Cd污染环境中得以生存。但目前已知的Cd超富集植物普遍存在富集量有限和富集系数低等缺点,影响了推广和应用。随着转基因技术的发展,通过基因工程的手段对Cd超富集植物进行基因改造,是实现Cd污染环境植物修复实际应用的有效方法。本研究选择了分布广泛、易获得的Cd超富集植物龙葵(Solanum nigrum L.)进行转基因改造研究,利用农杆菌介导的方法建立转IRT1基因的龙葵毛状根体系,对转IRTl龙葵毛状根富集Cd的效果和可能的机制进行探讨,希望为转IRT1龙葵植株的再生和应用提供可靠的理论基础。方法：论文首先选取龙葵、油菜、芥菜3种Cd超富集植物进行毛状根的诱导,通过对3种植物毛状根组织富集Cd的能力和机制的初步研究,确定进行转基因改造的目标植物为龙葵。然后对龙葵毛状根的诱导条件进行进一步的优化,考查不同发根农杆菌菌种、预培养时激素萘乙酸(NAA)浓度、不同的外植体来源、不同的外植体类型对龙葵毛状根诱导的影响。在对龙葵毛状根诱导条件进行优化的基础上,利用Takara公司的pRll0.7质粒将与Cd富集相关的IRT1基因整合进入发根农杆菌ATCC15834中,并利用改造过的转IRT1-ATCC15834菌液侵染龙葵叶片外植体,诱导获得转IRT1基因毛状根。建立起稳定的转IRT1龙葵毛状根液体悬浮培养体系后,利用PCR技术进行IRT1基因、rolB基因的检验,确定IRT1基因、rolB基因已经整合到植物毛状根组织的DNA中；利用Western blot技术进行目的蛋白的检验,确定IRT1基因的蛋白表达情况。最后对转IRT1基因毛状根进行Cd富集实验研究。将转IRT1龙葵毛状根与野生型龙葵毛状根分别置于含不同浓度Cd的培养液中进行暗培养。14 d后取样进行毛状根生长状态、生物量、Cd含量、ROS(活性氧,Reactive Oxygen Species)积累情况、细胞凋亡情况、抗氧化酶系统活性、IRT1蛋白表达情况的分析和比较,探讨转入IRT1基因对提高龙葵毛状根耐受Cd能力的影响。结果：根据龙葵、油菜和芥菜三种植物的毛状根诱导生根率、毛状根液体悬浮培养体系建立后毛状根的生长状况、毛状根组织富集Cd能力的比较,发现龙葵毛状根生物量大、富集Cd的能力较好,在Cd浓度为100μmol/L的条件下培养14 d后鲜重可达2.897 g,毛状根中的Cd含量可达745.023μg/g,是适合用于进一步进行转基因改造的目标植物。对龙葵毛状根诱导条件优化的结果表明,利用发根农杆菌ATCC15834侵染生长3周的龙葵无菌苗外植体叶片(预培养NAA浓度为0.6mg/L),毛状根的诱导效果最好,此条件下生根率达90%以上。利用含IRT1基因的重组菌ATCC15834侵染龙葵叶片外植体获得了转IRT1龙葵毛状根,rol B、IRT1基因的PCR检测结果表明毛状根DNA中存在423 bp、1044bp大小条带,证明rol B基因、IRT1基因已经整合进入龙葵毛状根组织。Western blot技术检验发现IRT1基因目的蛋白已有表达。Cd胁迫实验结果表明,在无Cd处理的对照条件下,转IRTl龙葵毛状根与未转入IRTl的野生型龙葵毛状根在各方面评价指标中均无明显差异；随着培养液中Cd浓度的升高,野生型和转IRTl龙葵毛状根都能有效地耐受高浓度Cd的胁迫作用,但转IRT1龙葵毛状根的耐受能力优于野生龙葵毛状根。在不同Cd浓度下,转IRTl龙葵毛状根与野生型龙葵毛状根相比,褐化程度都较小,生长状态更好。在含100 μmol/LCd的培养液中培养14 d后,与未经Cd处理的对照组毛状根相比,野生型龙葵毛状根鲜重减少了26.2%,干重减少了18.0%；而转IRT1龙葵毛状根在含100μmol/LCd的培养液中培养14 d后,与未经Cd处理的转IRTl龙葵毛状根相比鲜重仅减少了6.0%,干重减少了2.5%,对比可知,转入IRTl基因的龙葵毛状根生物量受Cd毒害作用的影响较小。从Cd的富集量来看,在Cd浓度为100gmol/L的条件下,转IRT1龙葵毛状根和野生型龙葵毛状根中Cd的富集量分别为886.759 gg/g和745.023μg/g,表明转IRT1龙葵毛状根表现出更优的Cd富集效果。并且在Cd胁迫下,转IRT1龙葵毛状根比野生型龙葵毛状根的抗氧化酶活性(CAT、SOD、POD)更强,IRT1蛋白表达量高；而ROS积累程度和细胞凋亡程度比野生型毛状根小,说明转IRT1龙葵毛状根比野生型龙葵毛状根细胞受损伤的程度小。上述结果表明IRT1基因的转入较好地提高了龙葵毛状根对Cd的耐受能力,实现了对龙葵毛状根的转基因改造目标。论文建立的转基因自主生长毛状根体系可作为重金属吸附机理研究的可靠实验体系,研究结果为将来获得转IRT1基因龙葵再生植株提供了一定的应用理论基础。
【关键词】：镉超富集植物 龙葵 毛状根 发根农杆菌 IRT1 发根农杆菌 芥菜 油菜
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q945.78
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 1 引言14-20
• 1.1 重金属镉(Cd)超富集植物研究现状14-15
• 1.1.1 重金属Cd污染土壤修复研究的进展14
• 1.1.2 现有重金属Cd超富集植物开发及研究现状14-15
• 1.1.3 龙葵应用于Cd污染土壤修复的优势15
• 1.2 重金属Cd超富集植物的转基因改造进展15-17
• 1.2.1 植物富集Cd的分子机制16
• 1.2.2 重金属Cd超富集植物转基因改造现状16-17
• 1.3 毛状根组织在植物修复研究中的应用17-19
• 1.3.1 重金属超富集植物的转基因改造研究方法17-18
• 1.3.2 毛状根的特性及应用于植物修复中的优势18-19
• 1.4 本实验的研究目的和意义19-20
• 1.4.1 目的19
• 1.4.2 意义19-20
• 2 实验材料和方法20-43
• 2.1 实验材料20-24
• 2.1.1 生物材料20
• 2.1.2 试剂、耗材、主要仪器20-22
• 2.1.2.1 试剂及仪器采购厂家20-21
• 2.1.2.2 仪器信息21-22
• 2.1.3 试剂的配制22-24
• 2.1.3.1 培养基的配制22-23
• 2.1.3.2 缓冲液的配制23-24
• 2.1.3.3 抗生素的配制24
• 2.2 实验方法24-43
• 2.2.1 菌种的活化及保存24-26
• 2.2.2 Cd超富集植物毛状根诱导的摸索及目标Cd超富集植物的选择26
• 2.2.3 毛状根的诱导26-27
• 2.2.4 毛状根诱导条件的优化实验设计27-28
• 2.2.5 毛状根基因组的提取和PCR检测28-29
• 2.2.6 三种植物Cd富集实验设计29-33
• 2.2.7 龙葵毛状根生长曲线的测定33
• 2.2.8 IRT1编码基因的合成33-34
• 2.2.9 重组质粒pRI101-IRT1的获得34-37
• 2.2.10 转基因发根农杆菌的获得和菌种保藏37-38
• 2.2.11 转基因发根农杆菌的PCR检测38
• 2.2.12 转IRT1龙葵毛状根的获得及鉴定38
• 2.2.13 转IRT1龙葵毛状根总蛋白的提取和Western blot检测分析38-41
• 2.2.14 龙葵毛状根Cd胁迫响应实验设计41-42
• 2.2.15 数据整理和统计学分析42-43
• 3 实验结果与讨论43-72
• 3.1 三种Cd超富集植物毛状根诱导的比较及转基因改造目标植物龙葵的确定43-58
• 3.1.1 发根农杆菌菌种对不同植物外植体生根诱导的影响43-45
• 3.1.2 三种Cd超富集植物毛状根的PCR检验及rolB基因鉴定45-46
• 3.1.3 最佳诱导条件下三种Cd超富集植物生根效果的比较46
• 3.1.4 三种Cd超富集植物毛状根富集Cd能力的分析46-54
• 3.1.4.1 Cd处理后三种植物毛状根生长状态的比较46-48
• 3.1.4.2 Cd处理后三种植物毛状根生物量的比较48-49
• 3.1.4.3 三种植物毛状根富集Cd含量的比较49
• 3.1.4.4 Cd处理对三种植物毛状根细胞损伤程度的比较49-51
• 3.1.4.5 Cd处理对三种植物毛状根抗氧化还原酶系统活性的变化比较51-54
• 3.1.5. 转基因改造目标植物龙葵的确定54
• 3.1.6 转基因改造目标植物龙葵毛状根诱导条件的进一步优化54-57
• 3.1.6.1 不同激素浓度对不同的龙葵外植体生根诱导的影响54-55
• 3.1.6.2 不同来源的材料诱导龙葵毛状根的差异55-56
• 3.1.6.3 龙葵毛状根液体培养体系的建立56-57
• 3.1.7 龙葵毛状根生长曲线的测定57-58
• 3.1.8 小结58
• 3.2 pRI101-IRT1载体的构建及转IRE1龙葵毛状根体系的建立58-62
• 3.2.1 质粒pUC57、pRI101的双酶切鉴定58
• 3.2.2 连接产物的转化结果分析58-60
• 3.2.3 转基因发根农杆菌中IRT1基因的PCR鉴定60
• 3.2.4 转IRT1龙葵毛状根和对照组毛状根的形态比较60
• 3.2.5 转IRT1龙葵毛状根DNA中IRT1基因的PCR结果60-62
• 3.2.6 转IRT1龙葵毛状根DNA的测序结果62
• 3.2.7 转IRT1龙葵毛状根目的蛋白表达结果62
• 3.2.8 小结62
• 3.3 转IRT1龙葵毛状根对Cd胁迫响应的初步探讨62-72
• 3.3.1 Cd处理下转IRT1龙葵毛状根和对照组毛状根生长状况的对比62-64
• 3.3.2 Cd处理对转IRT1龙葵毛状根和对照组龙葵毛状根生物量的影响64-65
• 3.3.3 转IRT1-龙葵毛状根和对照组毛状根富集Cd效果的比较65
• 3.3.4 Cd处理下转IRT1龙葵毛状根和对照组毛状根中ROS的积累和细胞损伤程度的比较65-68
• 3.3.5 Cd处理对转IRT1龙葵毛状根和对照组毛状根抗氧化还原酶系统(SOD、POD、CAT)活性的变化比较68-70
• 3.3.6 Cd处理对转基因龙葵毛状根中IRT1蛋白表达的分析和比较70-71
• 3.3.7 小结71-72
• 4 结论72-74
• 参考文献74-78
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果78-80
• 学位论文数据集80

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