热泉菌Bacillus sp.BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究

发布时间：2017-08-05 03:15

  本文关键词：热泉菌Bacillus sp.BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究

  更多相关文章： 嗜热微生物 脂肪酶 基因克隆 异源表达 酶学性质

【摘要】：热泉是耐高温脂肪酶的一个重要来源,它具有独特的生境环境,为嗜热微生物提供了良好的生存环境,耐高温脂肪酶具有良好的热稳定性、较高的反应速率等特点。耐高温的脂肪酶在生物催化上具有其他常温脂肪酶不可比拟的优点,特别是在洗涤行业具有较好的发展前景。因此,研究热泉微生物和其产生的耐高温脂肪酶具有重要的理论意义和生产前景。本课题以印度洋卡利安达岛东海岸热泉样品为材料,通过样品稀释、平板划线、罗丹明B平板检测等方法,根据单菌落在罗丹明B平板上的透明圈直径大小,获得一株高产脂肪酶菌株BI-19；通过16S rRNA鉴定以及系统发育分析,发现其和Bacillus. sp亲缘关系较近,所以初步鉴定为芽孢杆菌属,并命名为Bacillus.sp BI-19。为提高Bacillus. sp BI-19的酶活,首先进行了培养条件优化,分别以不同培养pH、不同接种量、不同碳源、不同碳源浓度、不同氮源、不同氮源浓度、不同金属离子、不同的三丁酸甘油酯浓度和不同装液量作为唯一变量进行单因素实验。根据单因素的结果利用minitab软件设计PB实验,筛选出的对脂肪酶活性影响较为显著的三个影响因子(硫酸铵、KCl、三丁酸甘油酯),根据这三个影响因子设计最陡爬坡实验,最后利用Design-Expert软件设计响应面并分析,最终得到当硫酸铵的质量分数为0.65%,三丁酸甘油酯的浓度为0.03%,KCl的浓度为5.57mmol/L时,Bacillus. sp BI-19酶活最高,可达50.5U/ml,是优化前的2倍。为实现Bacillus.sp BI-19产脂肪酶的高效异源表达,我们首先通过构建基因组DNA质粒文库的方法筛选获得了两个脂肪酶编码基因的完整开放阅读框(ORF),分别命名为lip-0256和lip-1954。然后利用基因工程手段将脂肪酶基因lip-0256和lip-1954分别连接到表达载体pET-30(a+)中,并成功转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3).两株重组菌破碎细胞上清酶活测定表明,重组酶Lip-1954酶活较Lip-0256高,且Lip-1954的可溶性表达可达50%,因此本论文以重组菌pET-30(a+)-lip-1954作为后续的研究菌株。为研究重组酶Lip-1954的酶学性质,首先对重组酶Lip-1954进行纯化。因表达载体pET-30(a+)上具有His标签,所以本研究采用镍离子亲和层析对Lip1954进行分离纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳检测显示为较单一条带,在30KD左右,大小与预测一致。纯化后的Lip-1954的酶学性质研究表明,Lip-1954重组酶的最适反应温度为70℃,而且该酶在60～75℃时酶活还保持在50%左右的酶活；其最适pH为9,说明该酶属于碱性脂肪酶,在洗涤剂领域具有潜在应用；在反应体系中加入Cu2+、Cd2+、Sr2+、Mg2+、Na+、Fe3+、K+、Ca2+、Fe2+、Pb2+,其中Na+、Fe3+、Cd2+、K+、Fe2+对Lipase-1954具有促进作用,其中Fe3+的促进作用最为显著达到200%,而Cu2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、pb2+对Lip-1954具有抑制作用。重组酶Lip-1954对有机溶剂的耐受性研究结果表明,该酶对丙三醇(甘油)和正丁醇的耐受性较好,且对其催化活性具有促进作用,特备是在加入正丁醇的反应体系中,其酶活是未加有机溶剂的两倍；而在反应体系中加入甲醇、乙醇、三氯甲烷、石油醚、正己烷,其酶活也能保持在60%以上,表明Lip-1954对有机溶剂具有较好的耐受性。
【关键词】：嗜热微生物 脂肪酶 基因克隆 异源表达 酶学性质
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q936
【目录】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 第一章 前言16-22
• 1.1 脂肪酶的简介16-20
• 1.1.1 脂肪酶的来源16-17
• 1.1.2 脂肪酶的结构和催化机理17-18
• 1.1.3 脂肪酶的研究现状18-19
• 1.1.4 脂肪酶的应用19-20
• 1.2 耐高温脂肪酶20-22
• 1.2.1 本论文耐高温脂肪酶的来源20-21
• 1.2.2 耐高温脂肪酶的研究现状21-22
• 1.3 本课题的研究目的和意义22
• 第二章 产耐高温脂肪酶菌株的筛选和鉴定22-28
• 2.1 实验材料23-24
• 2.1.1 材料和试剂23
• 2.1.2 培养基23-24
• 2.2 实验方法24-25
• 2.2.1 初筛24
• 2.2.2 复筛24
• 2.2.3 脂肪酶酶活的测定24-25
• 2.2.4 基因组DNA的提取25
• 2.2.5 16S rRNA基因的PCR扩增25
• 2.2.6 系统发育树的构建25
• 2.3 实验结果与分析25-28
• 2.3.1 初筛与复筛25-26
• 2.3.2 菌株BI-19号菌的种属鉴定26-28
• 2.4 小结与讨论28
• 第三章 Bacillus sp.BI-19菌株的发酵条件优化28-41
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 菌株29
• 3.1.2 试剂29
• 3.2 试验方法29-36
• 3.2.1 制备种子液29
• 3.2.2 标准曲线的制备29-30
• 3.2.3 菌株的生物量和酶活曲线30
• 3.2.4 单因素实验30-32
• 3.2.5 设计Plackett-Burman实验32-33
• 3.2.6 最陡爬坡实验33-34
• 3.2.7 Box-Behnken设计及结果34-36
• 3.3 实验结果与分析36-40
• 3.3.1 BI-19号菌株的生长曲线和产酶曲线36-37
• 3.3.2 单因素实验结果37-39
• 3.3.3 响应面分析结果39-40
• 3.4 实验小结与讨论40-41
• 第四章 Bacillus sp.B1-19菌株基因组DNA质粒文库的构建与耐高温脂肪酶基因的克隆41-47
• 4.1 实验材料41-42
• 4.1.1 菌株与常用软件41
• 4.1.2 实验试剂41-42
• 4.2 实验方法42-43
• 4.2.1 基因组DNA提取42
• 4.2.2 基因组DNA质粒文库的构建42
• 4.2.3 产高温脂肪酶基因克隆的筛选42
• 4.2.4 高温脂肪酶的基因序列分析42-43
• 4.3 实验结果与分析43-47
• 4.3.1 基因组DNA的提取43
• 4.3.2 菌落PCR检测和测序验证43-44
• 4.3.3 阳性克隆的筛选44
• 4.3.4 脂肪酶基因的序列分析44-47
• 4.4 实验小结与讨论47
• 第五章 脂肪酶基因lip-1954和lip-0256的异源表达47-55
• 5.1 实验材料与方法48-49
• 5.1.1 实验菌株48
• 5.1.2 实验仪器48
• 5.1.3 实验试剂48-49
• 5.2 试验方法49-51
• 5.2.1 基因组DNA的提取49
• 5.2.2 设计引物并引物PCR49
• 5.2.3 琼脂糖凝胶回收49
• 5.2.4 连接pMD18-T simple载体49-50
• 5.2.5 质粒提取和PCR检测50
• 5.2.6 双酶切和琼脂糖凝胶回收50
• 5.2.7 连接到表达载体pET-30(a+)并PCR检测50
• 5.2.8 转化入T0P10并测序50-51
• 5.2.9 提取TOP10的质粒并转化入BL21中51
• 5.2.10 耐高温脂肪酶的诱导表达51
• 5.3 实验结果与分析51-54
• 5.3.1 基因组DNA提取和引物PCR51-52
• 5.3.2 重组酶的诱导表达结果52-54
• 5.4 实验小结和讨论54-55
• 第六章 重组酶Lip-1954的酶学性质研究55-61
• 6.1 实验材料55
• 6.1.1 菌株与仪器55
• 6.1.2 主要试剂55
• 6.2 实验方法55-57
• 6.2.1 目的蛋白的分离纯化56
• 6.2.2 重组酶的酶学性质研究56-57
• 6.3 实验结果与分析57-60
• 6.3.1 蛋白纯化57-58
• 6.3.2 酶学性质研究58-60
• 6.4 实验小结与讨论60-61
• 第七章 总结和展望61-63
• 参考文献63-73
• 致谢73-74
• 硕士期间发表文章74-75
• 附件75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 尹海滨;王婷;郑萍;;真菌细胞溶壁酶的分离纯化及其酶学性质研究[J];广州化工;2010年07期

2 赵冠杰;杨志强;郭养浩;;枇杷核醇腈酶的高效分离纯化及酶学性质研究[J];福州大学学报(自然科学版);2011年02期

3 于宏伟;栗志丹;郝珊珊;贾英民;;蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J];农产品加工(学刊);2006年10期

4 夏俊刚;何逵夫;谢希贤;徐庆阳;陈宁;;枯草芽孢杆菌嘌呤核苷磷酸化酶酶学性质研究及在利巴韦林酶法合成中的应用[J];中国生物工程杂志;2010年12期

5 陈静;邢岩;周皓芹;佟金;陈玉香;;一株产乙酰酯酶细菌筛选、鉴定及酶学性质研究[J];微生物学通报;2012年06期

6 陕婧婧;窦文芳;李会;张旦旦;许泓瑜;陈敬华;许正宏;;硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究[J];生物技术通报;2012年08期

7 罗鏊琳;陈彩芳;张洋;叶秀云;;一种木聚糖酶的分离及其酶学性质研究[J];科技资讯;2006年14期

8 卢婵;郑璞;孙志浩;;L-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究[J];中国生物工程杂志;2013年06期

9 王晓红;茆军;傅力;顾美英;王伟;段继华;;低温淀粉酶产生菌的筛选及酶学性质研究[J];农产品加工(学刊);2007年01期

10 胡长浩;施文芳;沈麟;林琳;;脂肪酶菌种的筛选、鉴定及酶学性质研究[J];生物技术;2009年02期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 汤鸣强;谢必峰;吴松刚;;复合酶制剂中果胶酶不同组分的分离纯化及其酶学性质研究[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

2 汤鸣强;谢必峰;吴松刚;;复合酶制剂中果胶酶不同组分的分离纯化及其酶学性质研究[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年

3 包怡红;李雪龙;;类芽孢杆菌木聚糖酶产生菌株的筛选及其酶学性质研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

4 陈昭;田元勇;朱蓓薇;;鱿鱼肝脏蛋白酶的酶学性质研究[A];中国食品科学技术学会第八届年会暨第六届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 刘波;红曲霉生淀粉酶发酵优化、分离纯化及其酶学性质研究[D];四川农业大学;2014年

2 黄平;沉积微杆菌TPS/TPP基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];福建农林大学;2016年

3 林小洪;产木聚糖酶海洋微生物的选育及酶学性质研究[D];福州大学;2014年

4 刘秀萌;热泉菌Bacillus sp.BI-19产耐高温脂肪酶的基因克隆及其酶学性质研究[D];山东大学;2016年

5 盛嘉元;脂环酸芽孢杆菌产耐酸耐高温淀粉酶及酶学性质研究[D];南京理工大学;2009年

6 韩萍;低温淀粉酶的分离、纯化及其酶学性质研究[D];昆明理工大学;2007年

7 赵献春;产脱枝酶菌株的筛选酶的分离纯化及酶学性质研究[D];江南大学;2009年

8 刘爽;耐冷菌Pseudomonas sp.W7产低温蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究[D];黑龙江大学;2012年

9 黄加保;芥蓝抗坏血酸过氧化物酶在大肠杆菌中的基因表达及酶学性质研究[D];江南大学;2013年

10 封胜雪;两种新型嗜热酯酶的克隆、表达及酶学性质研究[D];郑州轻工业学院;2013年

，

本文编号：622940