cPLA2α基因敲除小鼠的构建、繁殖与鉴定

发布时间：2017-08-05 04:10

  本文关键词：cPLA2α基因敲除小鼠的构建、繁殖与鉴定

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【摘要】：目的:c PLA2α能够高选择性地水解膜磷脂,起始花生四烯酸和溶血磷脂级联反应,释放一系列炎症因子,促进炎症反应。本课题组前期研究发现,c PLA2α在乳腺癌和肝癌患者组织中高表达,并且c PLA2α在乳腺癌细胞运动侵袭,肝癌细胞运动及上皮间充质转化中具有重要作用。为了系统性地研究c PLA2α在肿瘤发生发展中的作用,我们利用先进的TALEN技术构建了c PLA2α基因敲除小鼠模型,繁殖得到基因敲除纯合子,并对其进行一系列的鉴定,最后通过体内实验证实c PLA2α在肿瘤发生和转移中的作用。方法:1.分析c PLA2α基因序列,设计TALEN打靶载体,利用PCR与Golden Gate法组装TALEN载体;2.将TALEN载体体外转录的m RNA注射入小鼠受精卵中,经母鼠代孕及与野生型杂交后获得TALEN敲除F0及F1代小鼠;3.利用F1代基因敲除杂合子小鼠进行大规模的饲养繁殖;4.提取幼鼠脚趾DNA,经PCR与测序后鉴定幼鼠基因型,得到c PLA2α基因敲除纯合子小鼠;5.提取基因敲除纯合子、杂合子及野生型小鼠组织蛋白,Western Blotting检测c PLA2α蛋白表达水平,验证基因敲除效果;6.收集三种基因型小鼠的代谢物,进行UPLC/Q-TOF-MS后分析代谢组学数据,寻找组间差异较大的代谢物;7.构建小鼠Lewis肺癌模型,证实c PLA2α在肿瘤生长和转移中的作用;DEN诱导小鼠肝癌模型,研究c PLA2α在肝癌发生中的作用。结果:1.选取c PLA2α基因中的外显子3作为TALEN靶标,成功构建了TALEN-L和TALEN-R载体;2.显微注射后得到3只阳性F0代小鼠,与野生型杂交后得到共7只F1代杂合子小鼠,分别缺失三种片段;3.利用4只F1代杂合子,经过8个月的饲养繁殖,总计生产34次,获得226只幼鼠;4.对每只小鼠标记及鉴定后,共得到c PLA2α基因敲除纯合子小鼠36只;5.c PLA2α敲除纯合子小鼠组织中,c PLA2α蛋白不表达,c PLA2α敲除杂合子小鼠c PLA2α蛋白表达水平比野生型低;6.代谢组学结果显示,花生四烯酸、溶血磷脂酸、前列腺素、白三烯、血栓素等代谢物在组间差异较大,可以将野生组与杂合组、纯合组的样本进行很好的区分;7.Lewis肺癌模型证实,c PLA2α敲除对肿瘤的生长无明显影响,但几乎完全抑制了肿瘤的肝转移;DEN在野生型和c PLA2α敲除小鼠中均成功诱导了肝癌。结论:1.利用TALEN技术成功构建了c PLA2α基因敲除小鼠,得到F1代基因敲除杂合子;2.繁殖得到了c PLA2α基因敲除纯合子小鼠,为后续研究c PLA2α与肿瘤发生发展的关系提供了重要的动物模型;3.从基因水平和蛋白水平两个方面对基因敲除纯合子小鼠进行了鉴定与验证;4.代谢组学分析了c PLA2α基因敲除所引起的代谢物改变,间接证实了基因敲除模型构建的成功,也为更深入的研究c PLA2α的生理功能提供了更多潜在标志物;5.c PLA2α基因敲除可显著抑制肿瘤的体内转移;成功构建了DEN肝癌诱导模型。
【关键词】：cPLA2α 基因敲除 TALEN 纯合子 鉴定 代谢组学
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语10-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 对象和方法16-29
• 1.1 实验材料16-20
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 常用试剂耗材16-17
• 1.1.3 主要试剂及溶液的配置17-19
• 1.1.4 主要仪器设备19-20
• 1.2 实验方法20-29
• 1.2.1 TALEN载体的构建20-21
• 1.2.2 显微注射及F0、F1代小鼠鉴定21
• 1.2.3 基因敲除小鼠的饲养与繁殖21-22
• 1.2.4 小鼠基因型鉴定22-24
• 1.2.5 小鼠c PLA2α蛋白表达水平鉴定24-26
• 1.2.6 代谢组学分析26-28
• 1.2.7 Lewis肺癌模型验证c PLA2α敲除对肿瘤体内转移的影响28
• 1.2.8 小鼠DEN诱导肝癌模型的建立28-29
• 结果29-42
• 2.1 TALEN载体构建29-30
• 2.2 显微注射F0及F1代小鼠情况30-32
• 2.3 小鼠繁殖生长情况32-33
• 2.4 小鼠基因型鉴定33-34
• 2.5 小鼠cPLA2α蛋白表达水平检测34-35
• 2.6 UPLC-QTOF质谱35
• 2.7 代谢组学分析35-39
• 2.8 lewis肺癌模型中cLPA2α敲除对肿瘤生长及转移的影响39-40
• 2.9 小鼠DEN诱导肝癌模型的建立40-42
• 讨论42-47
• 3.1 c PLA2α在肿瘤中的作用研究42-43
• 3.2 TALEN技术构建基因敲除小鼠的优势与限制43-44
• 3.3 基因敲除小鼠饲养繁殖中的问题44
• 3.4 代谢组学分析44-45
• 3.5 c PLA2α基因敲除小鼠的应用前景45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 附录54-60
• 综述 基因敲除技术的研究进展60-78
• 综述参考文献72-78
• 致谢78-79
• 个人简历79

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本文编号：623081