乌头GGPS基因克隆分析及双酯型生物碱生物合成途径分析

发布时间：2017-08-17 07:06

  本文关键词：乌头GGPS基因克隆分析及双酯型生物碱生物合成途径分析

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【摘要】：附子是毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品,具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛等功效,药用及人工栽培历史悠久,常被用于亡阳虚脱,肢冷脉微,虚寒吐泻及脘腹冷痛等症状,有毒。附子药用价值巨大,栽培历史虽久,但目前生产上仍然采用“山区育种,坝区栽培”的传统生产模式,栽培区每年引种的种源地都不固定,导致种源混乱及不稳定,迄今为止没有一个有效成分含量明显增高的栽培新品种。附子的主要生物活性成分乌头碱,在生物碱分类中属于二萜类生物碱,本研究通过对二萜类化合物生物合成中的关键酶基因r{牛儿基r{牛儿基焦磷酸合酶基因(GGPS)进行克隆及组织表达分析,同时通过HPLC对不同生长期、不同植物组织中主要的药用活性乌头碱：双酯型生物碱(新乌头碱、次乌头碱、乌头碱)进行含量检测,预测了GGPS基因的功能,探讨了乌头GGPS基因对于附子植物体内乌头碱类生物碱生物合成的作用,为揭示乌头碱类生物碱生物合成途径奠定了基础,为通过生物技术的方法培育具有高乌头碱含量的附子新品种提供了途径。本研究主要得到了以下结果：1、乌头GGPS基因的克隆：首次从附子种根组培材料中通过同源克隆的方式,结合RACE与转录组数据克隆得到了一个长为1420bp的cDNA序列,NCBI同源比对显示其与芍药丹参等物种GGPS基因同源性较高,与金盏花(Adonis aestivalis)同源性最高,达80%;ORF Finder显示其CDS区长为861bp,编码287个氨基酸；同源序列多重比对及分子系统进化分析表明其具有GGPS基因共有的2个多聚异戊二烯基合酶的特异序列“LMHDDLPCMDNDDLRRG" "IGLLFQVVDDILD",以及全部5个保守域；预测到GGPS蛋白分子质量为30.95kDa,等电点为5.24；亚细胞定位预测显示其主要在叶绿体中表达,线粒体及其他部位也有少量表达；多维结构分析显示其结构中无规则卷曲占30.56%,α-螺旋占65.28%,p-折叠占4.17%;结构比较显示其三维结构具有高度的保守性。2、GGPS基因在不同生长时期的表达：对所有材料的荧光定量PCR数据进行不同生长时期的纵向比较,结果显示,目的基因植株的不同生长时期都有不同程度的表达。具体到植物组织,不同植物组织在不同时期的表达量不同,表达峰值时期也有组织间差异,但总体来说就,其表达量与植株的生命代谢活动的强度呈现明显的正相关关系。3、GGPS基因在不同组织中的表达：GGPS基因在各组织中表达量差异较大。在生长旺盛期,组织间表达量比较为叶茎根须根。4、有效成分在不同组织中的含量：在每个批次的不同组织样品中都检测出了乌头碱,说明了在附子植株中乌头碱的合成部位并不仅限于根部,而是植株各个组织都有合成,但含量却不一样,从本研究结果来看,植株不同组织间乌头碱含量高低依次为须根子须根根子根叶茎。5、有效成分在不同生长时期的含量：在不同生长时期附子乌头碱含量检测实验结果中,不同组织在不同生长时期的含量不同,且线性关系也不一样,叶和根中含量随时间呈先升高后降低的趋势,茎中乌头碱含量一直升高,而须根中的乌头碱含量随时间变化不大。6、GGPS基因与乌头碱生物合成的关系：对于GGPS基因的表达及乌头碱含量分析发现,乌头碱的合成与目的基因的表达在植株部位上高度一致,且其表达强度随时间的趋势与乌头碱含量动态变化随时间的趋势一致,双变量相关性分析显示相关系数为0.993,表明在0.01水平上显著相关,说明了乌头碱的合成与GGPS基因的表达密切相关,从而可以推断得知乌头碱的生物合成与二萜代谢途径有关、其生物合成途径为从二萜到二萜生物碱的结论。
【关键词】：乌头 GGPS 基因克隆 qPCR 双酯型生物碱含量
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 缩略词表9-13
• 1 文献综述13-19
• 1.1 附子及其生物活性研究13-14
• 1.2 二萜生物碱研究14-16
• 1.3 植物GGPS基因研究16-17
• 1.4 植物基因克隆17
• 1.5 实时荧光定量PCR17-18
• 1.6 乌头碱类生物碱检测18
• 1.7 研究目的及意义18-19
• 2 材料与方法19-37
• 2.1 实验材料19-21
• 2.1.1 植物材料19-20
• 2.1.2 质粒、菌株20
• 2.1.3 试剂20-21
• 2.1.4 仪器与设备21
• 2.1.5 引物合成与序列测定21
• 2.2 GGPS基因全长克隆21-29
• 2.2.1 组织培养21-22
• 2.2.2 合成cDNA第一链22-23
• 2.2.3 简并引物设计23-24
• 2.2.4 核心序列PCR扩增24-26
• 2.2.5 3'RACE26-28
• 2.2.6 基因全长PCR扩增28-29
• 2.2.7 GGPS基因生物信息学分析29
• 2.3 基因组织表达分析29-34
• 2.3.1 RNA提取及反转录29-31
• 2.3.2 qPCR引物设计31-32
• 2.3.3 半定量PCR32-33
• 2.3.4 qPCR33-34
• 2.4 双酯型生物碱含量分析34-37
• 2.4.1 色谱条件34
• 2.4.2 提取方法34
• 2.4.3 方法学考察34-36
• 2.4.4 含量测定36-37
• 2.5 相关性分析37
• 3 结果与分析37-58
• 3.1 RNA提取及反转录37-38
• 3.2 GGPS基因克隆38-40
• 3.2.1 组织培养38
• 3.2.2 核心序列扩增38-39
• 3.2.3 3'RACE39-40
• 3.2.4 基因全长扩增40
• 3.3 GGPS生物信息学分析40-46
• 3.3.1 序列比对40-41
• 3.3.2 蛋白质翻译41-43
• 3.3.3 多重序列比对43-44
• 3.3.4 分子系统进化分析44-45
• 3.3.5 蛋白质理化性质与3D结构预测45-46
• 3.4 GGPS基因组织表达分析46-51
• 3.4.1 内参基因核心片段的获得及引物设计46-47
• 3.4.2 半定量PCR47-48
• 3.4.3 qPCR48-51
• 3.5 双酯型生物碱含量分析51-57
• 3.5.1 方法学考察51-55
• 3.5.2 含量测定分析55-57
• 3.6 相关性分析57-58
• 4 讨论及结论58-60
• 4.1 乌头GGPS基因克隆58
• 4.2 乌头GGPS基因的表达分析58-59
• 4.3 乌头乌头碱含量分析59
• 4.4 乌头GGPS基因与乌头碱生物合成59-60
• 参考文献60-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 吕佳韵;彭成;;甘草酸与乌头碱配伍对神经细胞的作用[J];中国实验方剂学杂志;2013年07期

2 尤超;赵大球;梁乘榜;周春华;;PCR引物设计方法综述[J];现代农业科技;2011年17期

3 潘伟明;刘文;杨妙贤;刘胜洪;梁红;;银杏GAPDH基因序列的初步克隆[J];广东农业科学;2010年08期

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本文编号：687657