犬子宫蓄脓内参基因及候选基因差异表达研究
本文关键词：犬子宫蓄脓内参基因及候选基因差异表达研究
【摘要】：犬子宫蓄脓是一种小动物临床常见病之一,多由子宫内膜的病变而引起,而子宫内膜的病变又与多种生长因子及其受体数量密切相关。目前,对本病的研究己进入分子生物学水平,其中不同生长因子对犬子宫内膜的作用机理尚不清楚,因此,本研究探索了在子宫蓄脓中最稳定的内参基因,之后运用筛选出的稳定的内参基因对IGF-2(胰岛素样生长因子2,insulin-like growth factor2,IGF2)和IGF1R(胰岛素样生长因子1受体,insulin-like growth factor1 receptor)的m RNA表达进行了分析,同时分析了蛋白在犬子宫组织中的表达情况。本研究中使用了7个候选内参基因(18SrRNA.ACTB,B2M,GAPDH,HPRT,RPL13A,YWHAZ),通过GeNorm,Normfinder,Best Keeper和RefFinder软件分析以及K.H.Sadek法分析这些内参基因在正常及病变犬子宫体组织中基因表达的稳定性。最后,采用RT-qPCR使用最稳定的内参基因对IGF2和IGF1R的mRNA表达量进行分析。之后运用免疫组化SP法在细胞水平上检测IGF2和IGF1R于犬子宫蓄脓组织及正常子宫组织中的表达。采用Western blot法从蛋白水平上检测IGF2和IGF1R在子宫蓄脓组织及正常子宫组织中的表达。综合分析后,我们筛选到了所有样品中,最稳定的内参基因YWHAZ。在正常与蓄脓组织中,选用不同的内参基因,IGF1R的mRNA表达量有很大差异。当选用不稳定的内参基因作为内参将会导致不准确的分析结果,这进一步证实了筛选内参基因的有效性和必要性。IGF2和IGF1R蛋白的阳性表达均主要定位于细胞的胞浆中。IGF-2蛋白在子宫蓄脓组织中的表达量极显著高于正常犬子宫内膜组织(P0.01)。IGF-2的mRNA在子宫蓄脓组织中的表达水平极显著高于正常犬子宫组织,差异具有统计学意义(P0.01)。IGF1R2蛋白在子宫蓄脓组织中的表达量极显著高于正常子宫内膜组织(P0.01)。IGF1R的mRNA在子宫蓄脓组织中的表达水平均显极著高于正常犬子宫组织,差异具有统计学意义(P0.01)。分析免疫组化结果显示IGF-1R阳性表达的上调与IGF-2的异常高表达之间低度相关(r=0.423),Western Blotting结果显示IGF-1R阳性表达的上调与IGF-2的异常高表达之间高度相关(r=0.927)。本研究筛选了正常犬与蓄脓犬子宫组织中最优内参基因,并检测了子宫蓄脓对子宫组织中IGF2和IGF1R表达量的影响。该成果不但为今后犬子宫蓄脓疾病在分子方面的的研究提供了一定的理论基础,并且阐明了IGF2和IGF1R在该病发展过程中的相关性,有望为子宫蓄脓的临床治疗与预防提供新的研究方向。
【关键词】：犬 内参基因 IGF2 IGF1R
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.292
【目录】：
- 摘要11-13
- Abstract13-15
- 第一章 引言15-31
- 1 犬子宫蓄脓研究背景及意义15-24
- 1.1 母犬的发情周期及其特点15-16
- 1.2 犬子宫蓄脓概述16-17
- 1.3 发情周期与子宫蓄脓的关系17-18
- 1.4 发病有关因素18-19
- 1.5 发病机理19-20
- 1.6 临床症状、病理变化及子宫蓄脓的分型20-22
- 1.7 检查及诊断方法22
- 1.8 与其他组织器官的损伤22-23
- 1.9 治疗方法23-24
- 2 荧光定量PCR24-27
- 2.1 荧光定量PCR24-25
- 2.2 内参基因概述25
- 2.3 内参基因筛选的软件及方法25-27
- 2.4 内参基因筛选的研究进展27
- 3 IGF2与IGF1R结构及功能的研究进展27-29
- 3.1 IGF家族27-28
- 3.2 IGF家族在子宫疾病中的作用28-29
- 3.3 IGF2的结构与功能29
- 3.4 IGF1R的结构与功能29
- 4 本研究目的及意义29-31
- 第二章 犬子宫蓄脓子宫荧光定量PCR内参基因的筛选31-47
- 1 材料31-32
- 1.1 子宫来源31
- 1.2 主要试剂31
- 1.3 主要仪器和设备31-32
- 2 方法32-35
- 2.1 犬子宫的采集和处理32
- 2.2 犬子宫内膜的RNA提取32
- 2.3 RNA纯度检测32
- 2.4 RNA反转录32-33
- 2.5 RT-q PCR33-34
- 2.6 引物设计34
- 2.7 标准曲线的制作34
- 2.8 引物扩增效率计算34
- 2.9 数据分析34-35
- 3 结果与分析35-44
- 3.1 RNA完整度及纯度检测结果35
- 3.2 基因的克隆35-36
- 3.3 引物特异性检测及扩增效率36-38
- 3.4 K.H.Sadek分析结果38-39
- 3.5 geNorm软件分析结果39-42
- 3.6 NormFinder软件分析结果42-43
- 3.7 Best Keeper软件分析结果43
- 3.8 RefFinder分析结果43-44
- 3.9 IGF1R用不同内参基因作为参考的相对表达量44
- 4 讨论44-47
- 第三章 RT-qPCR法检测犬子宫中IGF2和IGF1R的表达47-51
- 1 材料47
- 1.1 组织来源47
- 1.2 主要试剂47
- 1.3 主要仪器和设备47
- 2 方法47-48
- 2.1 犬子宫的采集和处理47
- 2.2 犬子宫内膜的RNA提取47
- 2.3 RNA纯度检测47-48
- 2.4 RNA反转录48
- 2.5 RT-q PCR48
- 2.6 引物设计48
- 2.7 统计分析48
- 3 结果与分析48-50
- 3.1 RNA完整度及纯度检测结果48
- 3.2 引物特异性检测48-49
- 3.3 IGF1R和IGF2的相对表达量49-50
- 4 讨论50-51
- 第四章 子宫蓄脓对犬子宫内膜组织中IGF-2及IGF-1R蛋白表达的影响51-59
- 1 材料51-52
- 1.1 组织来源51
- 1.2 主要试剂51
- 1.3 主要仪器和设备51-52
- 2 方法52-53
- 2.1 免疫组织化学PV法检测52
- 2.2 Western blotting检测方法52-53
- 2.3 数据分析53
- 3 结果和分析53-57
- 3.1 免疫组化IGF-2 表达检测结果53-54
- 3.2 免疫组化IGF-1R表达检测结果54-55
- 3.3 IGF-2，IGF-1R Western Blotting实验结果55-56
- 3.4 IGF-1R和IGF-2 表达的相关性56-57
- 4 讨论57-59
- 结论59-60
- 参考文献60-67
- 致谢67-68
- 附录68-71
- 附录 1 中英文缩略词汇表 Abbreviations table68-69
- 附录 2 候选基因名称，，功能、引物序列、产物长度、退火温度及扩增效率69-71
- 攻读学位期间发表的论文71
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