蛹虫草和蝉花组氨酸激酵基因的表达以及蛹虫草组氨酸激酶蛋白检测

发布时间：2017-08-19 11:15

  本文关键词：蛹虫草和蝉花组氨酸激酵基因的表达以及蛹虫草组氨酸激酶蛋白检测

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【摘要】：组氨酸激酶是双组份系统的重要部分,而双组份系统是真菌感受外界刺激的重要机制,它使真菌能适应和应答环境的改变。蝉花和蛹虫草是传统的药食两用真菌,通过对其组氨酸激酶基因的研究,在理论上比较同为它们的组氨酸激酶基因的表达调控差异。根据已知的蛹虫草组氨酸激酶基因(CmHK)的序列来设计引物,对蝉花组氨酸激酶基因IcHK进行克隆,克隆获得的序列经过测序、比对,最终获得了IcHK基因的开放阅读框(ORF)序列,全长为2811bp。对序列进行分析表明,IcHK基因可编码963个氨基酸残基,它的翻译产物IcHK有4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase_c功能域和1个REC功能域。长期以来,对组氨酸激酶的研究主要聚焦在它对外界信号的表达调控上,且近年来有关杀真菌剂表达调控的研究颇多。采用实时荧光定量PCR方法研究了三种杀真菌剂(咯菌腈、异菌脲和克菌丹)对蛹虫草组氨酸激酶CmHK和蝉花组氨酶激酶IcHK表达的影响。结果表明,CmHK基因和IcHK基因对这三种杀菌剂的敏感性均有所不同:这三种杀菌剂不能导致CmHK基因的相对转录量明显增加,因此CmHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响不敏感;而它们都可导致IcHK基因的相对转录量的增加,说明IcHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响都敏感,尤其对咯菌腈和克菌丹更为敏感。针对已获得的蛹虫草组氨酸激酶基因,设计两种方法来制备抗体,一种方法是通过原核表达CmHK基因的部分序列获得融合表达蛋白,并以此作为抗原制备抗体。依据CmHK基因ORF序列及其功能域分析,将其分为两段(CmHK1和CmHK2)分别设计引物,将PCR获得的CmHK1和CmHK2两个部分序列分别连接表达载体pET-41a(+),最终转化到BL21(Escherichia coli)受体细胞,以构建CmHK1和CmHK2的原核表达系统。利用IPTG诱导融合蛋白的表达,并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin纯化表达蛋白。纯化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作为抗原免疫家兔后获得了两种抗体anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一种方法是化学合成CmHK抗原决定簇短肽,偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体。化学合成三条短肽HK3、HK4和HK5后,分别与BSA偶联作为抗原制备了三种抗体anti-HK3、anti-HK4和anti-HK5。将这两种方法获得的抗体通过Western blotting方法检测CmHK在蛹虫草中的存在形式。Western blotting分析发现只有anti-CmHK2没有出现特异性条带,其他抗体均有特异性条带出现。在蛹虫草菌丝体中均可检测到两条特异的蛋白杂交带,分别为85 kDa和45 kDa,表明组氨酸激酶CmHK的可能存在形式有85kD和45kD两种。
【关键词】：蛹虫草 蝉花 组氨酸激酶 杀真菌剂 实时荧光定量PCR Western blotting
【学位授予单位】：江西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-16
• 1.1 蛹虫草10
• 1.2 蝉花10-11
• 1.3 双组份系统11-14
• 1.3.1 双组份系统概述11
• 1.3.2 双组份系统的基本结构11-12
• 1.3.3 双组份系统的反应机制12-13
• 1.3.4 双组份系统的分类13-14
• 1.4 本研究的目的与意义14-16
• 2 蝉花组氨酸激酶（IcHK）基因的克隆和序列分析16-28
• 2.1 实验材料与试剂16-18
• 2.1.1 实验菌株16
• 2.1.2 试剂16-17
• 2.1.3 主要仪器17-18
• 2.1.4 培养基的配制18
• 2.1.5 溶液的配制18
• 2.2 引物设计18-19
• 2.3 实验方法19-21
• 2.3.1 蝉花菌丝体的培养19
• 2.3.2 蝉花菌丝体总RNA的提取19
• 2.3.3 DNA去除反应19-20
• 2.3.4 RNA反转录20-21
• 2.3.5 IcHK基因ORF的PCR分析21
• 2.3.6 基因测序及序列分析21
• 2.4 实验结果及分析21-27
• 2.4.1 蝉花总RNA提取21-22
• 2.4.2 消化后的蝉花总RNA22
• 2.4.3 IcHK基因ORF序列PCR22-23
• 2.4.4 基因测序及序列分析23-27
• 2.5 讨论与小结27-28
• 3 蛹虫草和蝉花组氨酸激酶基因受杀菌剂影响的表达28-36
• 3.1 实验材料28-29
• 3.1.1 实验菌株28
• 3.1.2 试剂28
• 3.1.3 主要仪器28-29
• 3.1.4 培养基的配置29
• 3.1.5 溶液的配置29
• 3.2 引物设计29-30
• 3.3 实验方法30-32
• 3.3.1 蛹虫草和蝉花菌丝体的培养30
• 3.3.2 蛹虫草菌丝体和蝉花菌丝体的杀菌剂培养和取样30
• 3.3.3 蝉花和蛹虫草菌丝体RNA的提取30
• 3.3.4 基因组DNA的去除和RNA反转录30-31
• 3.3.5 Real-Time PCR反应31
• 3.3.6 Real-Time RCR反应数据处理31-32
• 3.4 实验结果及分析32-35
• 3.4.1 蛹虫草和蝉花总RNA的提取32
• 3.4.2 咯菌腈对组氨酸激酶表达水平的real-time PCR检测分析32-33
• 3.4.3 异菌脲对组氨酸激酶表达水平的real-time PCR检测分析33-34
• 3.4.4 克菌丹对组氨酸激酶表达水平的real-time PCR检测34-35
• 3.5 讨论与小结35-36
• 4 蛹虫草组氨酸激酶CmHK抗体的制备及其western blotting初步分析36-58
• 4.1 实验材料36-39
• 4.1.1 实验菌株36
• 4.1.2 试剂36-37
• 4.1.3 主要仪器37
• 4.1.4 培养基的配制37
• 4.1.5 溶液的配制37-39
• 4.2 制备组氨酸激酶CmHK抗体所需抗原蛋白的选择39
• 4.2.1 CmHK原核表达CmHK基因部分序列39
• 4.2.2 CmHK中部分序列的化学合成39
• 4.3 实验方法39-49
• 4.3.1 蛹虫草菌丝体的培养39-40
• 4.3.2 蝉花菌丝体总RNA的提取40
• 4.3.3 DNA去除反应40
• 4.3.4 RNA反转录40
• 4.3.5 CmHK基因ORF部分序列PCR及琼脂糖凝胶电泳检测40-41
• 4.3.6 利用E.Z.N.A. ~(TM)Gel Extraction Kit胶回收PCR产物41
• 4.3.7 质粒与PCR片段的双酶切41-42
• 4.3.8 利用E.Z.N.A. ~(TM)Cycle-Pure Kit回收PCR产物42
• 4.3.9 双酶切质粒和双酶切片段的连接42-43
• 4.3.10 转化43
• 4.3.11 PCR方法鉴定正确表达方向的阳性重组子43
• 4.3.12 质粒抽提43-44
• 4.3.13 酶切分析阳性重组质粒44-45
• 4.3.14 测序45
• 4.3.15 CmHK基因ORF部分的表达45
• 4.3.16 CmHK基因ORF两个部分的表达蛋白的SDS-PAGE45-47
• 4.3.17 CmHK基因ORF两个部分的表达蛋白的纯化47
• 4.3.18 抗体的制备47
• 4.3.19 抗体的纯化47-48
• 4.3.20 ELISA检测多克隆抗体效价48
• 4.3.21 Western Blotting48-49
• 4.4 实验结果及分析49-56
• 4.4.1 蛹虫草总RNA49
• 4.4.2 消化后的蛹虫草总RNA49-50
• 4.4.3 CmHK基因ORF部分序列PCR及产物纯化50
• 4.4.4 原核表达载体的构建与验证50-51
• 4.4.5 基因测序结果及序列分析51-53
• 4.4.6 表达蛋白的SDS-PAGE结果53
• 4.4.7 纯化蛋白 SDS-PAGE 结果53-54
• 4.4.8 ELISA结果54-55
• 4.4.9 Western Blotting结果55-56
• 4.5 讨论与小结56-58
• 参考文献58-66
• 致谢66-67
• 在读期间公开发表论文（著）及科研情况67

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本文编号：700397