小麦泛素基因Ta-Ub2改善短柄草非生物胁迫耐性研究

发布时间：2017-08-23 02:33

  本文关键词：小麦泛素基因Ta-Ub2改善短柄草非生物胁迫耐性研究

  更多相关文章： 泛素 小麦 短柄草 非生物胁迫 抗氧化能力

【摘要】：泛素是一种高度保守的小分子球状蛋白,广泛存在于真核生物中。泛素26S蛋白酶体途径与植物的非生物胁迫响应密切相关,而泛素作为泛素26S蛋白酶体系统中的一员起着极其重要的作用。本实验室前期研究表明,小麦泛素基因Ta-Ub2在双子叶植物烟草的逆境胁迫过程中起重要作用,且该基因的表达加快了烟草的发育进程。本研究在克隆了小麦泛素基因Ta-Ub2的基础上,构建了Ta-Ub2基因的组成型和胁迫诱导型表达载体,转化单子叶模式植物短柄草,获得了过量表达和胁迫诱导表达泛素的转基因短柄草株系多个。利用转基因株系,研究了Ta-Ub2在单子叶植物短柄草生长发育及逆境耐性中的作用,分析了Ta-Ub2提高转基因短柄草非生物胁迫耐性的生理生化及分子机制。其主要结果和结论如下:(1)QRT-PCR分析结果表明,Ta-Ub2在小麦的根、茎、叶中均有表达,并且叶中的表达量最高,而根茎中的表达量最少。Ta-Ub2的表达受PEG、Na Cl和4?C冷胁迫的诱导上调。(2)通过基因组PCR及q RT-PCR检测鉴定,获得了不同表达水平的组成型和胁迫诱导型过表达小麦泛素基因Ta-Ub2的转基因短柄草植株。泛素蛋白丰度检测结果表明,正常条件下,转基因和野生型株系中泛素蛋白丰度没有明显差异,但干旱处理后,转基因植株体内多聚泛素蛋白丰度高于野生型,而泛素单体蛋白仍无明显差异。(3)在正常生长条件下,组成型过表达小麦泛素基因Ta-Ub2的转基因植株与野生型相比生长迟缓,前期株高较低,后期趋于相同,且千粒重下降。而诱导型转基因植株与野生型无明显差异。(4)组成型过量与诱导表达Ta-Ub2不仅提高转基因短柄草的干旱胁迫耐性,也提高了其盐胁迫和低温胁迫耐性。与野生型相比,干旱胁迫下,转基因短柄草具有较高的存活率、较高的相对含水量、较低的水分散失速率以及较高的生物量。同时,转基因短柄草的可溶性糖和脯氨酸含量较高,渗透势较低。这说明Ta-Ub2的过表达可以促进渗透调节物质的积累,降低渗透势,进而在一定程度上缓解由干旱胁迫造成的水分流失,促进植物体内的水分保持,提高植物的干旱耐性。(5)干旱胁迫下,转基因短柄草中H2O2含量以及O2·-产生速率均低于野生型,并且转基因短柄草中蛋白羰基化水平以及MDA含量也低于野生型。同时,转基因植株抗氧化酶活性水平总体较高。这些结果表明,Ta-Ub2的过表达提高了转基因植株的活性氧清除能力,降低了氧化胁迫对细胞造成的伤害。(6)检测了转基因植株中某些抗性相关基因的表达,包括抗氧化相关基因和胁迫相关转录因子基因。结果发现大部分被检测基因的表达量在转基因植株中的表达水平较野生型高。综上所述,在单子叶模式植物短柄草中过表达与诱导表达Ta-Ub2基因改变了转基因植株的生长发育表型,且与双子叶模式植物烟草中的表型不一致。过量表达与诱导表达该基因均提高了转基因短柄草的胁迫耐性,这与转基因烟草的结果一致。在生理生化水平上,转基因短柄草抗逆性的提高与细胞水分状况的维持以及抗氧化能力的提高有关。在分子水平上,Ta-Ub2参与了转基因植株中胁迫相关基因的表达调控。
【关键词】：泛素 小麦 短柄草 非生物胁迫 抗氧化能力
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-24
• 1.1 泛素/26S蛋白酶体系统13
• 1.2 泛素13-16
• 1.2.1 泛素的结构14-15
• 1.2.2 泛素的分布15
• 1.2.3 泛素的种类15-16
• 1.3 泛素启动酶系统16-18
• 1.3.1 泛素活化酶（E1）16-17
• 1.3.2 泛素结合酶（E2）17
• 1.3.3 泛素连接酶（E3）17-18
• 1.4 26S蛋白酶体18-19
• 1.5 泛素/26S蛋白酶体途径的功能19-21
• 1.5.1 泛素/26S蛋白酶体途径与植物激素信号途径19-20
• 1.5.2 泛素/26S蛋白酶体途径参与细胞周期调控20
• 1.5.3 泛素/26S蛋白酶体途径参与生物的胁迫适应过程20-21
• 1.6 植物启动子的研究进展21-23
• 1.6.1 组成型启动子21-22
• 1.6.2 诱导型启动子22
• 1.6.3 组织特异性启动子22-23
• 1.7 本研究的目的及意义23-24
• 2 材料与方法24-40
• 2.1 实验材料24-26
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 小麦与短柄草的培养及处理24
• 2.1.2.1 用于遗传转化的短柄草实验材料的培养24
• 2.1.2.2 用于基因克隆与基因表达分析的小麦实验材料的处理24
• 2.1.2.3 实验材料的处理24
• 2.1.3 菌株与转化质粒24
• 2.1.4 酶与生化试剂24-25
• 2.1.5 实验引物25-26
• 2.2 实验方法26-40
• 2.2.1 CTAB法提取短柄草基因组DNA26
• 2.2.2 Trizol法提取RNA26-27
• 2.2.3 反转录cDNA第一条链的合成27
• 2.2.4 Ta-Ub2基因的克隆27-28
• 2.2.5 琼脂糖凝胶回收28
• 2.2.6 链接反应28
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的转化28-29
• 2.2.8 菌落筛选29
• 2.2.9 DNA序列测定29
• 2.2.10 大肠杆菌质粒DNA的提取29-30
• 2.2.11 表达载体的构建30
• 2.2.12 农杆菌转化30-31
• 2.2.13 短柄草转化31-33
• 2.2.13.1 愈伤组织诱导31
• 2.2.13.2 农杆菌侵染愈伤组织31
• 2.2.13.3 转基因植株的筛选与再生31-32
• 2.2.13.4 转基因短柄草的PCR鉴定32
• 2.2.13.5 荧光定量PCR32-33
• 2.2.14 蛋白杂交检测33-36
• 2.2.14.1 植物总蛋白的提取33
• 2.2.14.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）33-34
• 2.2.14.3 半干法蛋白转移34-35
• 2.2.14.4 封闭及杂交35-36
• 2.2.15 生理指标测定36-39
• 2.2.15.1 失水速率的测定36
• 2.2.15.2 叶片相对含水量的测定36
• 2.2.15.3 叶绿素含量的测定36
• 2.2.15.4 土壤含水量的测定36-37
• 2.2.15.5 叶片渗透势的测定37
• 2.2.15.6 脯氨酸含量的测定37
• 2.2.15.7 可溶性糖的测定（蒽酮法）37-38
• 2.2.15.8 DAB和NBT染色38
• 2.2.15.9 过氧化氢含量的测定38
• 2.2.15.10 超氧阴离子自由基的测定38
• 2.2.15.11 丙二醛（MDA）的含量测定38-39
• 2.2.15.12 抗氧化酶活性的测定39
• 2.2.15.13 电导法测量植物电解质外渗39
• 2.2.16 统计分析39-40
• 3 结果与分析40-55
• 3.1 Ta-Ub2序列系统进化分析40
• 3.2 Ta-Ub2基因在小麦中的表达模式分析40-41
• 3.2.1 Ta-Ub2基因在小麦不同部位的表达40-41
• 3.2.2 Ta-Ub2基因对不同非生物胁迫处理的响应模式41
• 3.3 转基因短柄草的获得41-44
• 3.3.1 表达载体的构建41-42
• 3.3.2 短柄草的遗传转化42-43
• 3.3.3 转基因短柄草的筛选鉴定43-44
• 3.4 转基因短柄草植株的表型分析44-45
• 3.5 Ta-Ub2基因在短柄草逆境适应中的功能分析45-48
• 3.5.1 转Ta-Ub2基因短柄草在干旱胁迫下的生长分析45-46
• 3.5.2 过表达与诱导表达小麦Ta-Ub2基因对短柄草盐胁迫和低温胁迫耐性的影响46-48
• 3.6 过表达与诱导表达小麦Ta-Ub2基因提高短柄草抗逆性的生理生化及分子机制分析48-50
• 3.6.1 干旱胁迫下Ta-Ub2的过表达提高了短柄草多聚泛素蛋白的积累48-49
• 3.6.2 干旱胁迫对转基因短柄草渗透调节能力的影响49-50
• 3.7 过表达与诱导表达Ta-Ub2基因对转基因短柄草抗氧化能力的影响50-55
• 3.7.1 干旱胁迫对转基因短柄草过氧化氢含量和超氧阴离子自由基产生速率的影响50-51
• 3.7.2 干旱胁迫对转基因短柄草蛋白质羰基化水平及MDA含量的影响51-52
• 3.7.3 干旱胁迫对转基因短柄草抗氧化酶活性的影响52-53
• 3.7.4 干旱胁迫对转基因短柄草抗氧化酶相关基因及CBF转录因子基因表达的影响53-55
• 4 讨论55-59
• 5 结论59-60
• 参考文献60-67
• 致谢67-68
• 攻读学位期间发表论文情况68

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本文编号：722515