HPV16E6基因过表达载体构建及对Me180细胞侵袭与迁移的影响

发布时间：2017-08-24 19:57

  本文关键词：HPV16E6基因过表达载体构建及对Me180细胞侵袭与迁移的影响

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【摘要】：目的:构建HPV16E6过表达腺病毒载体,比较HPV16E6过表达组和空白载体组两组与空白对照组Me180细胞侵袭与迁移能力的大小,以及E-cadherin m RNA、蛋白的表达及其启动子甲基化的状态,探究HPV16E6对宫颈癌Me180细胞侵袭与迁移能力的影响及其机制。方法:1.构建HPV16E6腺病毒:将HPV16E6基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒p HBAd-MCMV-GFP,用Eco R I和Bam H I双酶切判定、运用PCR技术扩增并将其产物与p HBAd-MCMV-GFP结合并转化大肠杆菌,检测序列是否正确,然后取HPV16E6过表达腺病毒载体质粒及骨架质粒,用Lipofiter TM转染试剂介导将重组体腺病毒在293A细胞中的包装扩增纯化;2.病毒转染效果验证:将过表达HPV16E6腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞,空白腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞,以及未进行腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞分成3组:HPV16E6过表达组、空白载体组以及空白对照组,用过表达HPV16E6基因的腺病毒及其空白腺病毒载体感染Me180细胞,36小时后观察绿色荧光表达情况,观察荧光效果并运用Western-Blot实验检测3组细胞中HPV16E6的表达来验证其转染效果;3.细胞迁移与侵袭能力:运用Traswell迁移与侵袭实验检测过表达HPV16E6基因对宫颈癌Me180细胞系迁移与侵袭能力的影响;4.机制研究:运用RT-q PCR实验及Western-Blot实验检测3组细胞中E-cadherin m RNA及其蛋白的表达,分析HPV16E6基因对Me180细胞迁移与侵袭能力影响的机制,并进一步运用甲基化特异性PCR检测三组细胞E-cadherin甲基化状态进行验证。结果:1.通过琼脂糖凝胶电泳试验、测序结果证实了携带HPV16E6序列穿梭载体构建成功,荧光显微镜图片及Western blot结果显示过表达HPV16E6的腺病毒已成功转染至宫颈癌Me180细胞中,转染效率高(80%-90%);2.Transwell迁移与侵袭实验中,过表达HPV16E6腺病毒转染宫颈癌Me180细胞后,同空白对照组相比较其细胞的迁移与侵袭能力显著增强(P0.05),而空白载体组相对空白对照组,其细胞的侵袭与迁移能力无明显改变(P0.05);3.RT-q PCR及Western-Blot实验中,过表达HPV16E6组同空白对照组相比较,其E-cadherin m RNA及其蛋白的表达呈显著下降(P0.05),而空白载体组的与空白对照组相比较,其E-cadherin m RNA及其蛋白表达水平无明显变化(P0.05);4.甲基化特异性PCR显示,过表达HPV16E6组的细胞E-cadherin启动子区呈完全甲基化状态,其甲基化程度明显高于空白对照组(P0.05),而空白载体组甲基化程度与空白对照组相比较,无明显差异性(P0.05)。结论:1..HPV16E6基因可能通过下调宫颈癌细胞系Me180中E-cadherin的表达水平增强宫颈癌细胞系Me180细胞迁移与侵袭能力,进而促进癌细胞的侵袭与转移;2.表观遗传学方面,HPV16E6基因可通过上调E-cadherin启动子区甲基化水平从而抑制E-cadherin蛋白表达,可能是逆转宫颈癌侵袭与转移的潜在关键点。
【关键词】：HPV16E6 宫颈癌 侵袭 迁移 E-cadherin
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 符号说明11-14
• 第1章 引言14-16
• 第2章 材料与方法16-34
• 2.1 实验材料16-18
• 2.1.1 细胞来源16
• 2.1.2 实验试剂16-17
• 2.1.3 仪器和设备17-18
• 2.1.4 主要试剂的配制18
• 2.2 实验方法18-34
• 2.2.1 HPV16E6基因过表达腺病毒载体的构建18-22
• 2.2.2 转染目的细胞22-23
• 2.2.3 Western blot实验检测HPV16E6蛋白的表达23-26
• 2.2.4 Transwell细胞迁移实验26
• 2.2.5 Transwell测侵袭实验步骤26-27
• 2.2.6 Real-time qPCR实验检测三组细胞中E-cadherin mRNA表达27-29
• 2.2.7 Western blot检测三组细胞中E-cadherin蛋白的表达29
• 2.2.8 甲基化特异性聚合酶链反应29-32
• 2.2.9 统计学方法32-34
• 第3章 结果34-46
• 3.1 目的基因与载体双酶切结果34
• 3.2 酶切PCR的鉴定结果34-35
• 3.3 pHBAd-MCMV-GFP-HPV16E6重组腺病毒质粒测序结果35-36
• 3.4 腺病毒滴度测定结果36
• 3.5 腺病毒转染目的细胞Me180结果36-38
• 3.6 Western-Blot检测HPV16E6蛋白结果38-39
• 3.7 Transwell迁移实验结果39-41
• 3.8 Transwell侵袭实验结果41-42
• 3.9 荧光定量PCR检测三组细胞E-cadherin mRNA的表达水平42-43
• 3.10 Western-Blot检测E-cadherin蛋白在三组细胞中的表达43-45
• 3.11 甲基化特异性PCR结果45-46
• 第4章 讨论46-50
• 4.1 HPV16E6与宫颈癌侵袭与转移相关性46-47
• 4.2 HPV16E6调控E-cadherin参与EMT分子机制研究47-48
• 4.3 表观遗传学角度，HPV16E6参与宫颈癌侵袭与转移的机制48-50
• 第5章 结论50-52
• 参考文献52-56
• 综述：人乳头瘤病毒16E6癌蛋白与宫颈癌发生的分子56-64
• 参考文献60-64
• 攻读学位期间主要研究成果64-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：732832