小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因对苦马豆素合成影响的研究

发布时间：2017-08-26 07:37

  本文关键词：小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因对苦马豆素合成影响的研究

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【摘要】：小花棘豆Embellisia内生真菌体内可合成苦马豆素,苦马豆素是有毒生物碱,牲畜采食含苦马豆素的小花棘豆植物后,体内积累到一定程度导致中毒。苦马豆素是次级代谢产物,其合成途径复杂,目前该内生真菌苦马豆素的生物合成途径未知。本研究首次以小花棘豆Embellisia内生真菌野生株及其突变株为研究对象,应用反转录PCR检测该内生真菌中酵母氨酸还原酶基因的表达。用酶分析法对野生株和突变株内苦马豆素进行检测,还用液相色谱-质谱联用法对野生株和突变株内酵母氨酸和赖氨酸进行了检测分析。并在培养基中添加L-α-氨基己二酸、L-赖氨酸及L-吡啶羧酸等化合物,研究野生株和突变株中苦马豆素及代谢相关化合物酵母氨酸、赖氨酸的变化。用生物信息学软件分析小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶的cDNA序列结构,推导氨基酸的序列,分析肽链氨基酸的组成、结构及性质,预测内生真菌酵母氨酸还原酶疏水性和亲水性、跨膜区域、信号肽,二级和三级结构等特征,比较分析11个不同物种真菌中的酵母氨酸还原酶氨基酸序列,构建了系统进化树。主要研究结果如下：1.利用反转录PCR技术检测野生菌株和突变菌株,转录水平上在野生株中检测到酵母氨酸还原酶基因的表达；而在突变株中未检测到酵母氨酸还原酶基因的表达,但检测到选择标记基因潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的表达。2.利用α-甘露糖苷酶分析法检测内生真菌中苦马豆素的含量,PDA培养基上生长的野生株苦马豆素含量高于突变株的,当向野生株和突变株的培养基内添加L-α-氨基已二酸、L-赖氨酸及L-吡啶羧酸时促进了苦马豆素合成,随化合物添加浓度不同,苦马豆素合成增长量不同。3.利用液相色谱-质谱联用技术对小花棘豆内生真菌中苦马豆素合成的前体酵母氨酸和赖氨酸进行检测,突变株内酵母氨酸的含量比野生菌株的低,而赖氨酸的含量变化不明显。培养基内添加α-氨基己二酸时,野生株的酵母氨酸含量随添加浓度增加而降低,而赖氨酸含量无明显变化；突变株内酵母氨酸和赖氨酸含量在添加浓度为1×10-4mol/L时最高,各达到0.171μg/g和0.563μg/g。4.根据小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶cDNA的序列推导出的多肽含472个氨基酸,其中酸性氨基酸61个,碱性氨基酸57个,极性氨基酸111个,非极性氨基酸167个。该酶为无信号肽、无跨膜域的可溶性蛋白,其二级结构主要以随机卷曲为主,部分区域无序化。将该氨基酸序列与10个其它真菌的酵母氨酸还原酶的氨基酸序列进行对比分析,构建了系统进化树。
【关键词】：小花棘豆 Embellisia内生真菌 缺失突变株 苦马豆素 酵母氨酸还原酶基因
【学位授予单位】：内蒙古师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 1 引言10-23
• 1.1 小花棘豆内生真菌研究10-11
• 1.2 酵母氨酸还原酶基因11-12
• 1.3 苦马豆素12-19
• 1.3.1 苦马豆素概述12-13
• 1.3.2 苦马豆素分离与检测13-15
• 1.3.3 苦马豆素的生物合成15-19
• 1.4 赖氨酸代谢相关途径的研究19-22
• 1.4.1 α -氨基己二酸合成途径19-21
• 1.4.2 二氨基庚二酸合成途径21
• 1.4.3 赖氨酸分解途径21-22
• 1.5 研究目的及意义22-23
• 2 材料与方法23-33
• 2.1 实验材料23-26
• 2.1.1 研究材料23
• 2.1.2 试剂材料23-25
• 2.1.2.1 试剂23
• 2.1.2.2 药品配制23-25
• 2.1.3 引物25-26
• 2.1.4 仪器设备26
• 2.2 研究方法26-33
• 2.2.1 小花棘豆内生真菌培养26
• 2.2.1.1 培养基配制26
• 2.2.1.2 接种26
• 2.2.2 内生真菌总RNA提取与反转录PCR26-30
• 2.2.2.1 野生菌株和突变菌株总RNA提取26-27
• 2.2.2.2 总RNA浓度及纯度检测27
• 2.2.2.3 cDNA合成27-28
• 2.2.2.4 酵母氨酸还原酶RT-PCR检测28-29
• 2.2.2.5 突变型菌株潮霉素磷酸转移酶RT-PCR检测29-30
• 2.2.3 培养基内添加化合物对野生菌株和突变菌株内苦马豆素合成代谢的影响30
• 2.2.3.1 添加α-氨基己二酸培养30
• 2.2.3.2 添加赖氨酸培养30
• 2.2.3.3 添加吡啶羧酸培养30
• 2.2.4 小花棘豆内生真菌中苦马豆素的提取与检测30-31
• 2.2.4.1 苦马豆素提取30-31
• 2.2.4.2 酶分析法检测苦马豆素31
• 2.2.5 小花棘豆内生真菌中苦马豆素合成前体化合物酵母氨酸和赖氨酸的检测31-33
• 2.2.5.1 酵母氨酸及赖氨酸的提取31-32
• 2.2.5.2 液相色谱-质谱联用法检测32-33
• 3 结果与分析33-51
• 3.1 小花棘豆内生真菌培养33-34
• 3.2 小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因研究34-37
• 3.2.1 小花棘豆内生真菌总RNA检测结果34-35
• 3.2.2 酵母氨酸还原酶cDNA检测结果35-37
• 3.2.2.1 OW7.8菌株内酵母氨酸还原酶基因表达检测35-37
• 3.2.2.2 M1菌株内潮霉素抗性基因表达检测37
• 3.3 培养基添加不同化合物对内生真菌苦马豆素合成的影响37-39
• 3.3.1 培养基添加α-氨基己二酸培养的菌株内苦马豆素含量变化37-38
• 3.3.2 培养基添加L-赖氨酸培养的菌株内苦马豆素含量变化38-39
• 3.3.3 培养基添加L-吡啶羧酸培养的菌株内苦马豆素含量变化39
• 3.4 培养基添加α-氨基己二酸对内生真菌苦马豆素合成相关前体物影响39-43
• 3.4.1 内生真菌中酵母氨酸含量变化39-41
• 3.4.1.1 L-酵母氨酸标准品质谱39-41
• 3.4.1.2 L-酵母氨酸含量41
• 3.4.2 内生真菌中赖氨酸含量变化41-43
• 3.4.2.1 L-赖氨酸标准品质谱41-43
• 3.4.2.2 L-赖氨酸含量43
• 3.5 酵母氨酸还原酶氨基酸序列的生物信息学分析43-51
• 3.5.1 一级结构预测43-44
• 3.5.2 信号肽预测44
• 3.5.3 疏水性/亲水性分析44-45
• 3.5.4 跨膜区域分析45-46
• 3.5.5 氨基酸序列系统进化树46-49
• 3.5.6 二级及三级结构的预测分析49-50
• 3.5.7 固有无序化特征预测分析50-51
• 4 讨论与结论51-54
• 4.1 讨论51-52
• 4.1.1 小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因51
• 4.1.2 培养条件对菌株内苦马豆素合成的影响51-52
• 4.1.3 酵母氨酸还原酶生物信息学分析52
• 4.2 结论52-54
• 参考文献54-61
• 附录161-63
• 附录263-64
• 致谢64-65
• 作者简介65

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1 哈布拉;小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因对苦马豆素合成影响的研究[D];内蒙古师范大学;2016年

2 王思远;小花棘豆Embellisia内生真菌酵母氨酸还原酶基因的克隆及其缺失载体的构建[D];内蒙古师范大学;2014年

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本文编号：740506