荔枝组织特异表达基因分析及叶片特异启动子的分离与鉴定

发布时间：2017-08-27 21:21

  本文关键词：荔枝组织特异表达基因分析及叶片特异启动子的分离与鉴定

  更多相关文章： 荔枝(Litchi chinensis Sonn.) 组织特异表达基因 启动子 基因枪瞬时表达 花粉管通道

【摘要】：转基因育种具有可定向改良性状,育种周期短等优势,是荔枝遗传改良的重要潜在育种手段。适宜的植物表达载体是转基因育种技术的关键,启动子是构建载体的核心元件。包含组织特异型启动子的载体可介导外源基因在特定组织表达,具有更多应用价值。本研究通过比较荔枝叶、根、果皮、果肉以及果核等不同组织的转录组差异,筛选获得组织特异性表达基因。以获得的其中两个叶片特异表达基因为对象,分别克隆获得了其启动子,构建连有荔枝类甜蛋白(LcTLP)基因的植物表达载体,通过基因枪进行了瞬时表达验证,并用花粉管通道法转入了荔枝基因组中。本研究的主要结果如下：1、对荔枝转录组数据进行了比较分析,获得了荔枝5个组织共2072个组织特异表达基因,分别是：1123个叶片特异表达基因,556个根特异表达基因,98个果皮特异表达基因,128个果肉特异表达基因,167个果核特异表达基因。对部分基因表达的定量PCR分析发现,这些基因的表达特征与转录组分析结果一致。2、应用PCR法克隆了两个叶片特异表达基因LcFKBP16-2和LcGRX的启动子。对这两个启动子的碱基序列进行分析,发现这两个启动子有很多相似性,如两个启动子均含有大量CAAT-box、TATA-box及与光应答作用相关的元件等。两个启动子序列均包含很多其它顺式调控元件。3、分别将LcFKBP16-2、LcGRX基因启动子与LcTLP基因、去CAMV 35S启动子的pCAMBIA1304质粒按一定顺序连接,构建了植物表达载体pCAMBIA1304-FKBP16-2-TLP、pCAMBIA1304-GRX-TLP。通过基因枪轰击法检测这两个表达载体在各组织中表达的特性,结果表明,这两个启动子均不能调控GUS基因在果肉中表达,但能调控GUS基因在其它组织如叶片、根、果皮以及果核中表达,表现出组织表达特异性。4、将构建的两个植物表达载体通过花粉管法转化紫娘喜和白糖罂荔枝,获得一批实生苗,从中鉴定出5株含pCAMBIAl304-FKBP16-2-TLP的白糖罂阳性植株。
【关键词】：荔枝(Litchi chinensis Sonn.) 组织特异表达基因 启动子 基因枪瞬时表达 花粉管通道
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S667.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-19
• 1.1 转录组测序(RNA-seq)技术及其应用研究进展10-12
• 1.1.1 转录组及RNA-seq概述10
• 1.1.2 转录组测序技术应用研究进展10-12
• 1.1.3 荔枝转录组研究进展12
• 1.2 启动子分类及研究进展12-15
• 1.2.1 组成型启动子12-13
• 1.2.2 诱导型启动子13
• 1.2.3 组织特异性启动子13-15
• 1.3 荔枝基因及启动子研究进展15-16
• 1.3.1 荔枝基因研究进展15
• 1.3.2 荔枝基因启动子研究进展15-16
• 1.4 转基因转化方法的研究进展16-17
• 1.4.1 基因枪法16
• 1.4.2 农杆菌介导法16-17
• 1.4.3 花粉管通道法17
• 1.5 研究目的及意义17-18
• 1.6 研究内容18-19
• 2 材料与基本实验操作19-21
• 2.1 材料、试剂与仪器19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 转录组数据获得及分析19
• 2.1.3 克隆载体和实验菌株19
• 2.1.4 酶和试剂19-20
• 2.1.5 引物合成及测序20
• 2.1.6 实验仪器20
• 2.1.7 试剂配制20-21
• 3 方法21-35
• 3.1 转录组数据分析21
• 3.2 实时荧光定量PCR验证21-27
• 3.2.1 荧光定量PCR引物设计22
• 3.2.2 荔枝RNA提取22-23
• 3.2.3 cDNA第一链的合成23-24
• 3.2.4 PCR克隆组织特异表达基因24
• 3.2.5 PCR产物回收24-25
• 3.2.6 回收产物连接和转化25
• 3.2.7 提取质粒25-26
• 3.2.8 实时荧光定量PCR标准品的构建方法26
• 3.2.9 实时荧光定量PCR(RT-PCR)反应26-27
• 3.3 启动子克隆与植物表达载体的构建27-30
• 3.3.1 提取荔枝基因组DNA(改良CTAB法)27
• 3.3.2 启动子及LcTLP基因克隆27-28
• 3.3.3 表达载体的构建28-30
• 3.3.4 连接目的片段30
• 3.3.5 酶切验证30
• 3.4 基因枪瞬时表达验证30-32
• 3.4.1 质粒提取30-31
• 3.4.2 微弹制备31
• 3.4.3 基因枪轰击材料31
• 3.4.4 GUS组织化学染色31-32
• 3.5 表达载体通过农杆菌介导花粉管侵入法转化荔枝32-35
• 3.5.1 制备农杆菌感受态32
• 3.5.2 冻融法转化农杆菌32
• 3.5.3 花粉管导入法32-33
• 3.5.4 实验操作33
• 3.5.5 转基因植株的检测33-35
• 4 结果与分析35-61
• 4.1 转录组分析结果35-46
• 4.1.1 表达分析35-36
• 4.1.2 GO分析和KEGG分析结果36-46
• 4.2 实时荧光定量PCR检测结果46-50
• 4.2.1 荔枝各组织RNA的提取以及反转录检测46-47
• 4.2.2 RT-PCR引物的溶解曲线分析47-48
• 4.2.3 标准曲线绘制48-49
• 4.2.4 九个基因在荔枝不同组织中的表达49-50
• 4.3 荔枝LcFKBP16-2与LcGRX基因的生物信息学分析50-51
• 4.4 启动子及LcTLP基因克隆51
• 4.5 启动子序列调控元件分析51-56
• 4.6 植物表达载体的构建56
• 4.7 基因枪瞬时检测56-57
• 4.8 花粉管导入法阳性植株检测57-61
• 5 讨论61-63
• 5.1 关于组织特异表达基因功能和代谢通路分析61
• 5.2 启动子结构元件与功能的关系61
• 5.3 荔枝转基因转化方法的研究61-63
• 6 结论63-64
• 参考文献64-69
• 缩略语表69-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郑婷婷;魏伟淋;杨向晖;林顺权;;基于枇杷转录组序列的SSR分子标记引物开发[J];亚热带植物科学;2015年04期

2 张绍阳;姚永;罗静;徐昌杰;;SSR标记技术及其在杨梅上的应用[J];安徽农业科学;2015年23期

3 敖妍;马履一;韩树文;杨晓辉;;基于高通量测序的文冠果转录组分析[J];中国生物工程杂志;2015年07期

4 王树军;刘保华;孙进华;肖茜;李焕苓;王家保;;荔枝多酚氧化酶基因启动子克隆与功能分析[J];果树学报;2015年03期

5 刘红弟;陈丽;康立敏;耿金曼;孙海悦;张志东;;基于转录组测序的越橘PDR转运蛋白基因的发掘及其表达分析[J];吉林农业大学学报;2015年06期

6 鄢秀芹;鲁敏;安华明;;刺梨转录组SSR信息分析及其分子标记开发[J];园艺学报;2015年02期

7 徐丹丹;王丕武;赵邯郸;刘双;陈昭汀;关淑艳;;农杆菌介导phyA基因转化玉米愈伤组织培养体系的优化[J];湖北农业科学;2015年02期

8 练从龙;卢秉国;赖钟雄;冯新;林玉玲;陈裕坤;张梓浩;;荔枝古树胚性愈伤组织LcCu/Zn-SOD3基因启动子的克隆及功能验证[J];西北植物学报;2015年01期

9 孟宪玉;单长建;王乾坤;田雨;王振华;邸宏;;玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因[J];玉米科学;2014年06期

10 杜人杰;曲跃军;金虎;陶双勇;邹威;王庆斌;周冬跃;张翼;付静;时平;;水曲柳DNA浓度及滴加时间对杨树花粉管通道法结实率的影响[J];安徽农业科学;2014年22期

，

本文编号：745933