胸膜肺炎放线杆菌potD2基因缺失株的构建及其生物学特性研究

发布时间：2017-08-27 22:15

  本文关键词：胸膜肺炎放线杆菌potD2基因缺失株的构建及其生物学特性研究

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【摘要】：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一类引起猪传染性胸膜肺炎的病原微生物。potABCD多胺转运系统普遍存在于各类原核细菌,其中PotD属于一种底物结合蛋白,能特异性识别并结合多胺,参与多胺胞内转运；在一些细菌中potD基因突变,将诱导细菌一系列生理功能以及致病性的改变；APP基因组中也存在假定的多胺转运蛋白编码基因potD2,为探究该基因对APP某些生物特性及毒力的影响,本研究首先以眉山猪场感染猪群分离的I型APP野毒株MS0721为母体,通过同源重组的原理构建potD2基因缺失株及其突变回复株,并探究突变株生物学特性的改变,主要内容如下：1、MSΔpotD2缺失株及其互补株C ΔpotD2的构建与鉴定参考NCBI已公布的APP1型4074基因组序列,以亲本株MS0721基因组为模板,设计引物分别扩增目的基因potD2的上下游序列同源臂；经两步法重叠延伸PCR,将左右同源臂融合后与自杀性质粒pEMOC2定向连接,PCR、酶切及测序分析鉴定正确,成功构建重组自杀性质粒pEMOC2-ApotD2。将重组自杀性质粒pEMOC2-ApotD2转化到供体菌β2155感受态,利用亲本株滤膜杂交的方法与APP MS0721共同培养,质粒pEMOC2-ΔpotD2通过结合转移的方式导入受体APP,通过正向筛选出氯霉素抗性、蔗糖敏感菌落,并PCR鉴定为整合了重组质粒的一次单交换菌株。随机挑选上述一次重组菌落,经传代培养后负向筛选出对蔗糖不敏感、无氯霉素抗性的双交换重组菌落,最终PCR鉴定成功筛选出4株potD2基因缺失突变株。同理参考4074基因组序列,设计引物扩增potD2整个阅读表达框架,酶切后与穿梭质粒PLS88定向连接,构建穿梭互补质粒pLS88-potD2, PCR及酶切鉴定正确,插入目的基因测序分析无碱基突变。利用电转法将互补质粒pLS88-potD2导入APPMSApotD2缺失株感受,并涂布于卡那抗性的TSA培养基,进而获得具有卡那抗性APP菌落,最后通过PCR鉴定,成功获得互补株C ΔpotD2。最后进行western blot鉴定结果显示,MS0721和互补株菌体变性蛋白中分离出目的蛋白条带约37KD,而MSΔpotD2突变株中无此目的条带,由此可见,potD2基因在突变株中不能表达,基因敲除成功,而在互补株中正常表达也说明互补株的成功构建。2、MSΔpotD2生物学特性及其小鼠毒力试验研究检测MSΔpotD2及互补株的稳定性表明MSΔpotD2和CΔpotD2传10代培养,每代均能正常生长繁殖,且potD2基因敲除后无回复突变,互补质粒也稳定存在。生长特性研究发现,MSΔpotD2缺失株在对数生长前期低于亲本株和互补株,然而几乎同时到达同一稳定平台期,这表明potD2基因的敲除仅对细菌生长活性无明显影响。菌液接种于含5%新鲜山羊血的TSA培养基,观察溶血情况表明三株菌株都具有完全溶血的活性,而MSΔpotD2溶血直径略低于MS0721及CΔpotD2。分别使用96孔培养法和试管培养法检测生物被膜的生成,结果发现三株菌株都不能形成生物膜,推测可能有细菌血清型有关。取对数生长期菌液MS0721、 MSΔpotD2及CΔpotD2稀释后于含0.3M KCl和NaCl的TSA平板中过夜培养,通过存活率比较来评估potD2基因对细菌耐高渗透压的影响,结果发现MSΔpotD2在高渗的环境中存活率低于亲本株和突变回复株,差异明显。此外研究菌株的耐氧化和耐热特性发现,经0.8mM的H202处理后,MSΔpotD2存活率不到10%,远低于亲本株MS0721和CΔpotD2;MSΔpotD2热激后的存活率也明显低于MS0721和CΔpotD2,以上说明potD2基因缺失后影响了APP的环境压力耐受能力。小鼠攻毒实验测各菌株半数致死量LD50,结果表明MSΔpotD2缺失株毒力略低于亲本株和互补株,但是差异不显著,说明potD2基因缺失对APP毒力的影响很小。
【关键词】：胸膜肺炎放线杆菌 多胺转运系统 基因敲除 生物特性 压力耐受
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略语表7-11
• 综述11-21
• 1 猪传染性胸膜肺炎概述11-12
• 2 胸膜肺炎放线杆菌致病机理12-14
• 3 细菌多胺及其代谢14-15
• 3.1 多胺合成14-15
• 3.2 多胺分解15
• 4 多胺与细菌致病性研究15-17
• 4.1 参与毒力蛋白的表达16
• 4.2 增强细菌逃避机体免疫16
• 4.3 影响细菌抗氧化胁迫和酸化胁迫16-17
• 4.4 影响生物膜的形成17
• 5 多胺转运蛋白PotD研究进展17-21
• 5.1 多胺转运系统18
• 5.2 多胺(亚精胺)结合蛋白PotD的研究18-20
• 5.2.1 大肠杆菌上研究进展18-19
• 5.2.2 肺炎双球菌中的研究进展19
• 5.2.3 蓝细菌中的研究进展19-20
• 5.2.4 其他细菌中的研究进展20
• 5.3 胸膜肺炎放线杆菌研究进展20-21
• 研究目的意义21-22
• 第一章 APP potD2基因缺失株及其互补株构建与鉴定22-49
• 1 材料22-24
• 1.1 实验菌株与质粒22
• 1.2 主要试剂22
• 1.3 培养基配置22-23
• 1.4 主要仪器23
• 1.5 引物设计23-24
• 2 方法24-37
• 2.1 胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA的提取24-25
• 2.2 potD2左右同源臂的扩增及融合25-26
• 2.3 重组自杀性转移质粒pEMOC2-△potD2的构建26-28
• 2.4 MS△potD2缺失株的构建28-31
• 2.4.1 pEMOC2-△potD2质粒的小量提取29
• 2.4.2 β2155大肠杆菌感受态的制备及转化29-30
• 2.4.3 结合转移30
• 2.4.4 正向筛选一次交换重组子及PCR鉴定30-31
• 2.4.5 负向筛选MS△potD2及PCR鉴定31
• 2.5 C△potD2互补株的构建31-34
• 2.5.1 potD2基因表达框架的扩增31-32
• 2.5.2 pLS88-potD2互补质粒的构建32-33
• 2.5.3 APP MS△potD2电转化感受态细胞的制备33
• 2.5.4 互补质粒pLS88-potD2的电转化33-34
• 2.5.5 互补株C△potD2的PCR鉴定34
• 2.6 potD2免疫印迹检测34-37
• 2.6.1 原核表达载体pET32a-potD2的构建34-35
• 2.6.2 PotD2蛋白的体外诱导表达35-36
• 2.6.3 重组蛋白的分离纯化36
• 2.6.4 PotD2蛋白抗血清的制备36
• 2.6.5 突变株免疫印迹鉴定分析36-37
• 3 结果37-45
• 3.1 potD2基因左右同源臂的扩增及融合37-38
• 3.2 重组自杀性质粒的PCR、酶切及测序鉴定38
• 3.3 缺失株的筛选与鉴定38-40
• 3.3.1 正向筛选鉴定38-39
• 3.3.2 负向筛选鉴定39-40
• 3.4 互补穿梭质粒的鉴定分析40-41
• 3.5 互补株筛选鉴定41-42
• 3.6 western blot鉴定42-45
• 3.6.1 重组表达质粒酶切鉴定42-43
• 3.6.2 重组蛋白PotD2的可溶性表达与纯化结果43-45
• 3.6.3 缺失株及互补株免疫印迹鉴定结果45
• 4 讨论45-48
• 4.1 关于缺失株的构建45-47
• 4.2 关于互补株的构建47-48
• 5. 小结48-49
• 第二章 MS△potD2缺失株及其互补株的生物学特性研究49-63
• 1 材料49
• 1.1 菌株49
• 1.2 主要试剂49
• 1.3 实验仪器与耗材49
• 1.4 实验动物49
• 2 方法49-52
• 2.1 遗传稳定性试验49-50
• 2.2 生长实验50
• 2.3 溶血性实验50
• 2.4 影响生物膜生成实50-51
• 2.5 压力耐受性实验51
• 2.6 小鼠致病性实验51-52
• 2.6.1 活菌平板计数51
• 2.6.2 LD_(100)和LD_0测定51-52
• 2.6.3 半数致死量的测定52
• 3 结果52-59
• 3.1 遗传稳定实验52-54
• 3.2 生长曲线的测定54
• 3.3 溶血活性结果54-55
• 3.4 生物膜实验55-56
• 3.5 压力耐受56-58
• 3.5.1 高渗透压耐受56
• 3.5.2 热激实验56-57
• 3.5.3 氧化耐受57-58
• 3.6 LD_(50)的测定58-59
• 4 讨论59-62
• 4.1 关于生长特性59
• 4.2 关于生物膜的形成59-60
• 4.3 关于抗环境压力胁迫60-62
• 5 小结62-63
• 结论63-64
• 参考文献64-71
• 致谢71

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：746100