少孢节丛孢中氨渗透酶基因敲除及线虫诱导捕器的活性物质研究

发布时间：2017-08-28 00:08

  本文关键词：少孢节丛孢中氨渗透酶基因敲除及线虫诱导捕器的活性物质研究

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【摘要】：课题组前期研究表明一些细菌可以产生尿素诱导少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)产生捕食器,并证实是尿素下游产物NH3发挥诱导功能。本论文通过对少孢节丛孢中的3个氨渗透酶基因AmtB80、AmtB43以及AmtB6进行敲除,初步探索NH3诱导少孢节丛孢产捕食器的分子机制。线虫能诱导捕食线虫真菌产生捕食器,本论文用活性追踪法对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的代谢产物进行诱导活性物质分离并对得到的活性物质进行广谱性测定,得到以下结果：1.用基因敲除技术敲除了少孢节丛孢中AmtB80,AmtB43以及AmtB6三个NH3渗透酶蛋白基因,得到三个敲除突变体AAmtB80、AAmtB43和AAmtB6,对三株敲除突变体和野生型菌进行了生长速率、菌落形态、线虫诱导、NH3诱导、产孢量、抗渗透压比较。发现,NH3诱导三株敲除株产生的捕食器都明显低于野生型,产孢量分析显示三株突变体产孢量明显降低。其他的生长速率、菌落形态、线虫诱导和抗渗透压没有明显变化。2.通过活性追踪从秀丽隐杆线虫(C. elegans)的代谢物中分离到化合物WF4-1,该化合物具有诱导捕器形成的活性。测定结果表明该化合物在0.02 mg/mL浓度下诱导效果最好,广谱性分析发现WF4-1可以诱导6株不同的捕食线虫真菌产生捕食器,其中卵形节丛孢YMF1.03316 (Arthrobotrys oviformis)、贵州节丛孢YMF1.00014 (Arthrobotrys guizhouensis)、少孢节丛孢YMF 1.01883 (Arthrobotrys oligospora)产生粘性网,(Drechslerella effuse)YMF 1.00583、空环单顶孢YMF 1.01480(Drechslerella coelobrocha)产生收缩环,长孢隔指孢YMF1.01460(Dactylelina leptospora)产生粘性球。全齿复活线虫(Panagrellus redivevus)的代谢物的LC-MS检测显示全齿复活线虫也可以产生WF4-1。本论文创新点：1.首次对少孢节丛孢中NH3渗透酶基因进行敲除。2.首次用活性追踪法从线虫中分离诱导捕食线虫真菌产捕食器的活性物质。
【关键词】：少孢节丛孢 NH_3渗透酶 线虫 WF4-1
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 文献综述9-16
• 1 前言9-10
• 2 捕食线虫真菌产生捕食器的诱导因素研究10-13
• 3 捕食线虫真菌产捕食器分子机制的研究13-15
• 4 本论文的内容和意义15-16
• 第二章 少孢节丛孢中氨渗透酶AmtB80、AmtB43和AmtB6功能的初步研究16-48
• 1 前言16-17
• 2 实验材料和方法17-29
• 2.1 实验所用菌株和质粒17
• 2.2 实验所用培养基和缓冲液17-18
• 2.3 实验所需试剂18
• 2.4 实验仪器18
• 2.5 实验方法18-29
• 3 实验结果29-46
• 3.1 少孢节丛孢中氨渗透酶的序列分析29-33
• 3.2 少孢节丛孢氨渗透酶的系统发育分析33-35
• 3.3 少孢节丛孢氨气渗透酶相关基因同源重组载体的构建35-37
• 3.4 转化子的筛选和PCR验证37-39
• 3.5 野生菌株和敲除菌株的比较39-46
• 4 小结与讨论46-48
• 第三章 秀丽隐杆线虫诱导捕食线虫真菌产捕食器活性物质的分离48-66
• 1 前言48-49
• 2 实验材料和方法49-56
• 2.1 所用线虫和菌株49
• 2.2 实验所用培养基和试剂49
• 2.3 实验所用仪器49-50
• 2.4 实验方法50-56
• 3 实验结果56-64
• 3.1 粗分样品对少孢节丛孢产捕器活性的诱导56-58
• 3.2 化合物的鉴定结果58-59
• 3.3 化合物WF4-1的梯度活性测定59-61
• 3.4 WF4-1广谱性测定61-64
• 4 小结与讨论64-66
• 全文总结66-67
• 附录67-70
• 参考文献70-75
• 硕士研究生期间科研成果75-76
• 致谢76

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本文编号：746424