南极适冷菌Psychrobacter sp.G温度适应相关假定蛋白基因的表达分析

发布时间：2017-08-29 03:30

  本文关键词：南极适冷菌Psychrobacter sp.G温度适应相关假定蛋白基因的表达分析

  更多相关文章： 适冷菌 转录组 假定蛋白 qRT-PCR western blotting

【摘要】：南极具有长年低温、干燥、低营养、强辐射及温度变化大等特点,蕴藏了极为丰富和特殊的微生物资源。转录组学研究表明,南极适冷菌Psychrobacter sp.G经冷激(0℃)和热激(30℃)胁迫后,分别有11和46、12和48个基因的表达量显著上调和下调,其中包括许多功能未知基因。本文对其中3个表达量显著变化的功能未知基因进行了基因克隆与序列分析,并利用qRT-PCR和western blotting技术分别从m RNA水平和蛋白水平进一步研究了其在不同温度/盐度胁迫条件下的表达情况,以期揭示该菌株适应南极特殊环境的分子机制。转录组测序比较分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_03870(AGP48309.1)经热激(30℃)后表达量可显著上升(log2FC=2.5,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为177 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,以及3′端终止密码子的下游有一个多聚腺苷酸信号序列AATAAA;氨基酸序列的疏水性分析表明,该基因编码的蛋白C端带有较强的疏水区域(score0),无跨膜区存在。BLASTP分析表明,与之相似性最高的功能蛋白为未命名蛋白产物(unnamed protein product,CCW68256.1)(37%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,该基因显著被低盐抑制,高盐诱导;温/盐协同胁迫下,该基因可显著被低温低盐(0℃,15)和低温高盐(0℃,90)诱导,高温低盐(30℃,15)和高温高盐(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,低温和高温胁迫下其蛋白表达量均可增加;盐度胁迫时,该蛋白表达亦可被低盐抑制,高盐诱导;温/盐协同胁迫下,6 h时,在高温低盐(30℃,15)条件下蛋白表达量变化不大,并且除在2 h、6 h时被高温高盐(30℃,90)诱导以外,其余条件下均被抑制。转录组测序比较分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_10180(AGP49518.1)经冷激(0℃)后表达量可显著上升(log2FC=4.1,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为624 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,以及位于起始密码子ATG下游10 bp处长14 bp的下游框;氨基酸序列的疏水性分析表明,该基因编码的蛋白C端带有较强的疏水区域(score0),其中181-203 AA为典型的跨膜区域,表明该蛋白可能为跨膜蛋白。BLASTP分析表明,与之相似性最高的已知功能蛋白为蓝光传感蛋白(blue light sensor protein,WP_010201745.1)(37%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温诱导,高温抑制;盐度胁迫时,所有盐度均显著抑制其表达;温/盐协同胁迫下,该基因显著被低温低盐(0℃,15)诱导,高温高盐(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,温度胁迫时,其蛋白表达于6 h内均被抑制,较长时间(12h)内均被诱导;盐度胁迫时,蛋白表达均可被低盐和高盐抑制;温/盐协同胁迫下,蛋白表达除在2 h时被高温低盐(30℃,15)诱导以外,其余条件下均被抑制。转录组测序比较分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_06740(AGP48869.1)经冷激(0℃)后表达量可显著下降(log2FC=-6.4,FDR≤0.05);基因序列分析表明,该基因ORF为1236 bp,基因上下游的调控序列包括-10、-35、TIS和RBS等调控区,位于位于-35区上游1 bp处的AT-rich UP element以及位于起始密码子ATG下游10 bp处长14 bp的下游框;氨基酸序列疏水性分析表明,蛋白没有明显的疏水区域,也不存在跨膜区域。BLASTP分析表明,与之相似性最高的已知功能蛋白为ATP相关结构域蛋白(ATP-grasp domain-containing protein,WP_011513612.1)(97%)。在mRNA水平上,该基因的表达显著被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,低盐和高盐胁迫下基因表达均被显著抑制;温/盐协同胁迫下,该基因的表达在低温低盐(0℃,15)时可极显著被诱导,高温高盐(30℃,90)时极显著被抑制。在蛋白水平上,其蛋白表达亦可被低温抑制,高温诱导;盐度胁迫时,蛋白表达均可被低盐和高盐诱导或抑制;温/盐协同胁迫下,蛋白表达在短时间(2 h)内均可被诱导,较长时间(12h)内均被抑制。本研究为揭示南极适冷菌Psychrobacter sp.G对极地极端环境的分子适应机制,阐明假定功能基因在南极适冷菌生境适应性中的作用提供了基础资料和科学依据。
【关键词】：适冷菌 转录组 假定蛋白 qRT-PCR western blotting
【学位授予单位】：国家海洋局第一海洋研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q93
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-27
• 1.1 极地微生物研究概况13-14
• 1.2 极地生物对温度适应性的研究进展14-19
• 1.2.1 冷激/热激蛋白14-17
• 1.2.2 冷适应蛋白17-19
• 1.2.3 假定蛋白19
• 1.3 基因组学、转录组学与假定蛋白基因的发现19-22
• 1.3.1 基因组学19-20
• 1.3.2 转录组学与假定蛋白基因的发现20-22
• 1.4 假定蛋白的功能探究22-25
• 1.5 目的意义及主要研究内容25-27
• 第二章 假定蛋白基因PSYCG_03870的克隆与序列分析及对温度/盐度胁迫的响应27-47
• 2.1 材料与方法28-33
• 2.1.1 菌株、培养基与试剂28-29
• 2.1.2 基因组DNA的提取29
• 2.1.3 引物设计与基因全长的获取29
• 2.1.4 基因序列分析29-30
• 2.1.5 原核表达载体的构建30
• 2.1.5.1 表达载体pET22b和目的基因的连接和转化30
• 2.1.5.2 重组子的鉴定30
• 2.1.6 重组菌的诱导表达、纯化与多克隆抗体的制备30
• 2.1.7 胁迫处理30-31
• 2.1.8 参比基因/蛋白的确定31-32
• 2.1.9 qRT-PCR32
• 2.1.10 Western blotting32-33
• 2.2 结果与分析33-44
• 2.2.1 假定蛋白基因PSYCG_03870的序列分析33-36
• 2.2.2 原核表达载体的构建36-37
• 2.2.3 假定蛋白PSYCG_03870在重组菌中的表达和纯化37-38
• 2.2.4 菌株G在不同温度/盐度胁迫下的生长曲线38-40
• 2.2.5 在mRNA水平上对温度/盐度胁迫的应答特征40-42
• 2.2.6 在蛋白水平上对温度/盐度胁迫的应答特征42-44
• 2.3 讨论44-45
• 2.4 小结45-47
• 第三章 假定蛋白基因PSYCG_10180的克隆与序列分析及对温度/盐度胁迫的响应47-63
• 3.1 材料与方法47-49
• 3.1.1 菌株、培养基与试剂47
• 3.1.2 基因组DNA的提取47
• 3.1.3 引物设计与基因全长的获取47-48
• 3.1.4 基因序列分析48
• 3.1.5 原核表达载体的构建48
• 3.1.5.1 表达载体pET22b和目的基因的连接和转化48
• 3.1.5.2 重组子的鉴定48
• 3.1.6 重组菌的诱导表达、纯化与多克隆抗体的制备48-49
• 3.1.7 胁迫处理49
• 3.1.8 参比基因/蛋白的确定49
• 3.1.9 qRT-PCR49
• 3.1.10 Western blotting49
• 3.1.11 重组菌株pET22b+ PSYCG_10180的抗冻活性测定49
• 3.2 结果与分析49-60
• 3.2.1 假定蛋白基因PSYCG_10180的序列分析49-53
• 3.2.2 原核表达载体的构建53-54
• 3.2.3 假定蛋白PSYCG_10180在重组菌中的表达和纯化54-55
• 3.2.4 在mRNA水平上对温度/盐度胁迫的应答特征55-57
• 3.2.5 在蛋白水平上对温度/盐度胁迫的应答特征57-59
• 3.2.6 重组菌株的抗冻融活性59-60
• 3.3 讨论60-61
• 3.4 小结61-63
• 第四章 假定蛋白基因PSYCG_06740的克隆与序列分析及对温度/盐度胁迫的响应63-78
• 4.1 材料与方法63-65
• 4.1.1 菌株、培养基与试剂63
• 4.1.2 基因组DNA的提取63
• 4.1.3 引物设计与基因全长的获取63-64
• 4.1.4 基因序列分析64
• 4.1.5 原核表达载体的构建64
• 4.1.6 重组菌的诱导表达、纯化与多克隆抗体的制备64-65
• 4.1.7 胁迫处理65
• 4.1.8 参比基因/蛋白的确定65
• 4.1.9 qRT-PCR65
• 4.1.10 Western blotting65
• 4.2 结果与分析65-75
• 4.2.1 假定蛋白基因PSYCG_06740的序列分析65-69
• 4.2.2 原核表达载体的构建69-70
• 4.2.3 假定蛋白PSYCG_06740在重组菌中的表达和纯化70-71
• 4.2.4 在mRNA水平上对温度/盐度胁迫的应答特征71-73
• 4.2.5 在蛋白水平上对温度/盐度胁迫的应答特征73-75
• 4.3 讨论75-77
• 4.4 小结77-78
• 第五章 总结与展望78-81
• 5.1 总结78-79
• 5.2 展望79-81
• 参考文献81-91
• 附录91-93
• 硕士期间发表文章93-95
• 致谢95

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本文编号：751114