不同启动子驱动DR1172转基因甘蓝型油菜的抗旱性研究

发布时间：2017-08-29 08:39

  本文关键词：不同启动子驱动DR1172转基因甘蓝型油菜的抗旱性研究

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【摘要】：干旱是植物生长发育过程中影响最大的非生物胁迫因素之一,它严重制约了全球农业的发展。目前,对植物的抗旱机理,以及培育具有抗旱的转基因新品种成为研究的热点。甘蓝型油菜,属于十字花科芸薹属,是植物蛋白和植物油主要来源之一。在我国,因干旱导致油菜年产量损失达20%以上。近来,利用基因工程技术,通过转入外源过表达基因来提高油菜的抗逆能力已经取得一定的成效,而增加的油菜抗逆功能的同时,又不影响油菜的品质和产量也受到了更多的关注。本实验,分别构建CaMV35S和At PUB19启动子驱动的DR1172基因的植物表达载体,利用农杆菌介导法转入甘蓝型油菜中,从而研究不同启动子对转DR1172基因甘蓝型油菜的抗旱性能力的影响,以及对转基因油菜生理生化造成的差异,最终筛选出综合性状良好的油菜新品种。目前,取得的成果如下:(1)分别构建了植物表达载体pCambia-At PUB19::DR1172和PBI121-CaMV35S::DR1172,并成功转化EHA105感受态细胞。(2)通过使用分析软件,发现AtPUB19启动子顺式作用元件上含有与干旱、脱水相关应答的元件、启动子和增强子的保守元件、启动子的核心保守序列,以及预测的两个转录起始点。(3)利用农杆菌介导法分别将EHA105中的植物表达载体转入甘蓝型油菜中,通过PCR检测,发现含有pCambia-At PUB19::DR1172的转基因植物78株和含有PBI121-CaMV35S::DR1172的转基因植物46株。(4)采用PEG6000模拟干旱实验处理的方法,分别对T1代种子(非转基、转At PUB19::DR1172、转CaMV35S::DR1172)进行不同PEG浓度的胁迫处理实验,以及20%PEG浓度下不同时间的胁迫处理实验。结果显示,在不同干旱情况下,CaMV35S和AtPUB19启动子都可有效的驱动DR1172基因的表达,但高度干旱胁迫时,与CaMV35S启动子相比较,AtPUB19启动子可更高效的驱动DR1172基因的表达,且显著提高油菜叶片的抗氧化酶活性。在不同时间的干旱胁迫后,转CaMV35S::DR1172基因组和转AtPUB19::DR1172基因组油菜叶片的抗氧化酶活性呈现上升趋势,而非转基因组呈先上升再下降的趋势。同时,CaMV35S启动子和AtPUB19启动子可驱动DR1172基因可缓解MDA对植物组织造成的伤害。AtPUB19启动子驱动的DR1172基因也减缓了叶绿素含量、相对含水量的降低速率,相对电导率的增加速率,以及提高了脯氨酸含量和可溶性糖含量,降低了干旱对植物造成的损失程度。(5)实时荧光定量PCR结果表明,随着干旱胁迫时间的持续性增加,CaMV35S启动子驱动DR1172基因在油菜叶片中的相对表达量维持在一个较低的水平,而AtPUB19启动子驱动的DR1172基因组在油菜叶片中的相对表达量随着干旱时间的增加而呈现较高的水平。(6)根据20%PEG处理不同时期的油菜叶片,其形态特征变化显示,高度干旱胁迫可提高At PUB19启动子驱动DR1172基因的抗旱水平,且高于CaMV35S启动能力。说明了CaMV35S驱动的基因在油菜表达中不具有时间特异性和组织特异性,而AtPUB19可根据植物不同的发育阶段和生长环境,对外源基因的表达进行定时、定点、定量的诱导表达,从而缓解干旱对其形状和品质的不良影响。
【关键词】：AtPUB19 CaMV35S DR1172 甘蓝型油菜 干旱
【学位授予单位】：西南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-27
• 1.1 植物抗旱性研究12-19
• 1.1.1 干旱对植物的影响12-13
• 1.1.2 植物抗干旱生理机制13-15
• 1.1.3 植物抗干旱分子机制15-19
• 1.2 调控基因表达的启动子研究进展19-22
• 1.2.1 组成型启动子19
• 1.2.2 组织特异型启动子19-20
• 1.2.3 诱导型启动子20-22
• 1.3 AtPUB19启动子与DR1172基因22-23
• 1.3.1 AtPUB19启动子22
• 1.3.2 DR1172基因22-23
• 1.4 研究目的和意义23-25
• 1.5 技术路线25-27
• 2 两种植物表达载体的构建以及AtPUB19启动子的生物信息学分析27-44
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 菌种27
• 2.1.2 菌用培养基27
• 2.1.3 试剂27
• 2.1.4 仪器和设备27-28
• 2.1.5 主要缓冲液28
• 2.2 方法28-35
• 2.2.1 构建植物表达载体PBI121-CaMV35S::DR1172和pCambia-AtPUB19::DR117228-30
• 2.2.2 大肠杆菌的活化30
• 2.2.3 载体片段的获取30-31
• 2.2.4 DR1172基因目的片段的获取31-32
• 2.2.5 DR1172基因与线性载体的重组连接32-33
• 2.2.6 感受态细胞的制备和连接产物的转化33-35
• 2.2.7 AtPUB19启动子的生物信息学分析35
• 2.3 结果与分析35-42
• 2.3.1 大肠杆菌的活化35-36
• 2.3.2 载体片段的获取36-37
• 2.3.3 DR1172基因目的片段的获取37-38
• 2.3.4 植物表达载体的重组连接和转化38-40
• 2.3.5 AtPUB19启动子的生物信息学分析40-42
• 2.4 讨论42-44
• 3 转基因阳性苗的获得44-58
• 3.1 材料44-45
• 3.1.1 植物材料44
• 3.1.2 植物培养基44-45
• 3.1.3 试剂45
• 3.2 方法45-48
• 3.2.1 农杆菌介导法实现油菜的遗传转化45-47
• 3.2.2 转基因油菜苗的PCR检测47-48
• 3.3 结果与分析48-54
• 3.3.1 农杆菌介导法获取转基因油菜48-53
• 3.3.2 转基因油菜苗的PCR检测53-54
• 3.4 讨论54-58
• 3.4.1 褐化现象54-55
• 3.4.2 白化现象55-56
• 3.4.3 玻璃化现象56-57
• 3.4.4 畸形现象57-58
• 4 不同启动子驱动DR1172转基因甘蓝型油菜的抗旱性研究58-82
• 4.1 材料58
• 4.1.1 植物材料58
• 4.1.2 试剂58
• 4.2 方法58-63
• 4.2.1 植物的培养和胁迫过程58-59
• 4.2.2 生理指标的测定与方法59-60
• 4.2.3 油菜叶片中CaMV35S::DR1172基因与AtPUB19::DR1172基因在干旱胁迫下相对表达量的检测60-63
• 4.2.4 数据统计分析63
• 4.3 结果与分析63-78
• 4.3.1 干旱胁迫下油菜叶片中叶绿素的变化63-65
• 4.3.2 干旱胁迫下油菜叶片中抗氧化酶活性的变化65-68
• 4.3.3 干旱胁迫下油菜叶片中相对含水量的变化68-69
• 4.3.4 干旱胁迫下油菜叶片中相对电导率的变化69-70
• 4.3.5 干旱胁迫下油菜叶片中可溶性糖的变化70-72
• 4.3.6 干旱胁迫下油菜叶片中丙二醛的变化72-73
• 4.3.7 干旱胁迫下油菜叶片中脯氨酸含量的变化73-74
• 4.3.8 干旱胁迫下不同启动子驱动的DR1172基因在甘蓝型油菜叶片 中的表达量74-75
• 4.3.9 植株形态特征的变化75-78
• 4.4 讨论78-82
• 4.4.1 不同启动子驱动的DR1172基因对甘蓝型油菜叶片中生理生化指标的影响78-81
• 4.4.2 不同启动子驱动的DR1172基因在甘蓝型油菜叶片中的表达情况分析81-82
• 结论82-85
• 致谢85-86
• 参考文献86-99
• 攻读学位期间发表的与学位论文相关的学术论文及研究成果99-100
• 附录 1100

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本文编号：752374