产漆酶菌株的筛选及漆酶基因的克隆表达

发布时间：2017-08-29 08:30

  本文关键词：产漆酶菌株的筛选及漆酶基因的克隆表达

  更多相关文章： 枯草芽孢杆菌 变色栓菌 漆酶 基因克隆 异源表达 酶学性质

【摘要】：秸秆等有机农业废弃物主要成分是木质素、纤维素和半纤维素,利用秸秆的关键就是降解包裹在纤维素和半纤维素外面的木质素。漆酶(EC 1.10.3.2)底物范围十分广泛,可以催化酚类、芳胺类和木质素等化合物,在环境治理、食品工业和木质素降解等方面都有广阔的应用前景。漆酶的生产主要来源于微生物发酵,但其发酵周期长,酶稳定性差,因此,本研究通过基因工程的手段进行漆酶基因的克隆,并进行异源表达来提高酶活力及产量,增加酶的稳定性主要研究结果如下：从土壤及腐败树木上分离到16株产漆酶细菌和6株产漆酶真菌,通过比较酶活力,确定1株漆酶活力较高的细菌QM11和1株漆酶活力较高的真菌Z6,在产酶培养基中酶活力分别达到了4.36 U/L和62.78 U/mL。根据形态学观察、生理生化鉴定和细菌16S rDNA保守区的基因测序分析,初步鉴定QM11细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。根据形态学观察,真菌ITS-rDNA保守区的基因测序分析,初步鉴定Z6真菌为变色栓菌(Trametes versicolor)。通过特异性引物进行QM11菌株及Z6菌株漆酶基因的克隆,得到细菌漆酶cotA基因长度为1542 bp,编码513个氨基酸,cotA蛋白相对分子量约为58 kDa,理论等电点为5.91。真菌漆酶lac1基因长度为1560 bp,编码519个氨基酸,lacl蛋白相对分子量为56 kDa,理论等电点为5.87。将变色栓菌Z6的漆酶lacl基因构建真核表达载体pPIC9K-lac1,并转化至毕赤酵母中,构建重组表达菌株P. pastoris GS115/pPIC9K-lac1,随后进行重组菌株的诱导表达,结果在BMMY培养基诱导72 h后出现酶活,最高达到了5.44 U/L。将枯草芽孢杆菌QM11的漆酶cotA基因构建原核表达载体pET22b-cotA,并转化至大肠杆菌中,构建重组表达菌株E.coli BL21/pET22b-cotA,并在16℃进行诱导表达,经SDS-PAGE检测结果显示实际分子量为70 kDa左右。随后将cotA蛋白通过Ni-NTA进行纯化,纯化后的重组cotA蛋白的比活力为136.73 U/mg,纯化倍数为7.83倍,回收率为40.29%。对纯化后的cotA蛋白进行酶学性质的研究,乡结果显示重组cotA蛋白的最适pH值为3,在pH 2-4的范围内稳定性较好,剩余酶活力均达到70%以上。重组cotA蛋白的最适温度为70℃,在60℃-80℃范围内热稳定性良好,80℃处理1h后仍有40%左右的酶活力。在每种离子浓度为1 mmol/L的环境中,Fe3+及Cu2+可显著提高重组cotA蛋白活性,分别提高了2.7倍和4.5倍,Fe2+强烈抑制cotA蛋白的活性,使cotA蛋白活性只有初始活力的17.26%,Ca2+及C02+对重组cotA蛋白的活性几乎无影响。以2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)为底物对重组cotA的动力学常数进行测定,经过计算得到Km=0.48 mmo1-L-1,Vmax=0.448 mmol·L-1·min-1。
【关键词】：枯草芽孢杆菌 变色栓菌 漆酶 基因克隆 异源表达 酶学性质
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;TQ925
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 1 绪论11-18
• 1.1 漆酶的特征及结构11-12
• 1.1.1 漆酶的来源11
• 1.1.2 微生物漆酶的理化特征11
• 1.1.3 微生物漆酶的结构11-12
• 1.2 常用基因异源表达系统12-14
• 1.2.1 大肠杆菌表达系统12-13
• 1.2.2 毕赤酵母表达系统13-14
• 1.3 漆酶基因克隆表达的国内外研究现状14-15
• 1.4 漆酶的应用进展15-16
• 1.4.1 环境治理15-16
• 1.4.2 食品工业中的应用16
• 1.4.3 造纸工业16
• 1.4.4 农业16
• 1.5 本研究的目的及意义16-17
• 1.6 课题的研究内容17-18
• 2 产漆酶菌株的筛选及鉴定18-30
• 2.1 实验材料与仪器18-19
• 2.1.1 主要试剂18
• 2.1.2 仪器与设备18-19
• 2.1.3 培养基19
• 2.2 实验方法19-22
• 2.2.1 样品采集19
• 2.2.2 产漆酶菌株的分离及初筛19
• 2.2.3 产漆酶菌株的复筛19
• 2.2.4 漆酶的酶活测定方法19-20
• 2.2.5 细菌形态观察及生理生化鉴定20
• 2.2.6 真菌菌落形态观察20
• 2.2.7 产漆酶细菌的16SrDNA分子生物学鉴定20-22
• 2.2.8 产漆酶真菌的rDNA-ITS序列分子生物学鉴定22
• 2.2.9 基因序列测定及序列分析22
• 2.3 结果与分析22-29
• 2.3.1 产漆酶细菌的分离与初步筛选22-23
• 2.3.2 产漆酶真菌的分离与初筛23
• 2.3.3 产漆酶菌种的酶活力复筛23-24
• 2.3.4 产漆酶细菌的形态学及生理生化鉴定24-25
• 2.3.5 QM11的分子生物学鉴定25-27
• 2.3.6 真菌Z6的鉴定27-29
• 2.4 本章小结29-30
• 3 QM11及Z6漆酶基因的克隆及序列分析30-46
• 3.1 实验材料与仪器30-31
• 3.1.1 菌种及载体30
• 3.1.2 主要试剂30
• 3.1.3 仪器与设备30
• 3.1.4 培养基30-31
• 3.2 实验方法31-34
• 3.2.1 QM11菌株漆酶cotA基因的克隆31-32
• 3.2.2 Z6菌株漆酶lac1基因的克隆32-34
• 3.2.3 cotA,lac1基因的序列分析34
• 3.3 结果与分析34-45
• 3.3.1 QM11菌株基因组DNA的提取及其cotA基因的扩增34-35
• 3.3.2 重组克隆质粒pMD18T-cotA的构建35
• 3.3.3 cotA基因的序列分析35-39
• 3.3.4 Z6总RNA的提取及lac1基因的扩增39-40
• 3.3.5 重组克隆载体pMD18T-lac1的构建40-41
• 3.3.6 lac1基因的序列分析41-45
• 3.4 本章小结45-46
• 4 cotA基因及lac1基因的异源表达46-56
• 4.1 实验材料与仪器46-47
• 4.1.1 菌种与质粒46
• 4.1.2 实验试剂46-47
• 4.1.3 仪器与设备47
• 4.1.4 培养基47
• 4.2 实验方法47-51
• 4.2.1 pET22b-cotA表达载体的构建及鉴定47-48
• 4.2.2 cotA基因重组菌株的诱导表达48-49
• 4.2.3 SDS-PAGE电泳检测49
• 4.2.4 pPIC9K-lac1表达载体的构建49-50
• 4.2.5 毕赤酵母感受态的制备和转化50-51
• 4.2.6 酵母表型的筛选及PCR鉴定51
• 4.2.7 重组酵母的诱导表达51
• 4.3 结果与分析51-55
• 4.3.1 重组质粒pET22b-cotA的构建及鉴定51-52
• 4.3.2 cotA基因的诱导表达52-53
• 4.3.3 重组质粒pPIC9K-lac1的构建和鉴定53
• 4.3.4 酵母的电转化及重组子的筛选53-54
• 4.3.5 lac1基因的诱导表达及活性检测54-55
• 4.4 本章小结55-56
• 5 重组漆酶cotA蛋白的纯化及酶学性质的研究56-65
• 5.1 实验材料与仪器56-57
• 5.1.1 菌种56
• 5.1.2 主要试剂56
• 5.1.3 仪器与设备56
• 5.1.4 重组蛋白纯化所用溶液56-57
• 5.2 实验方法57-59
• 5.2.1 诱导温度的选择57
• 5.2.2 粗酶液的制备57
• 5.2.3 镍柱亲和柱层析纯化57
• 5.2.4 SDS-PAGE电泳分析57
• 5.2.5 重组cotA蛋白浓度的测定57-58
• 5.2.6 纯化倍数及回收率的计算58
• 5.2.7 重组漆酶cotA蛋白的酶学性质研究58-59
• 5.3 结果与分析59-64
• 5.3.1 诱导时间的确定59
• 5.3.2 cotA蛋白的分离纯化59-61
• 5.3.3 cotA蛋白的酶学性质研究61-64
• 5.4 本章小结64-65
• 结论65-67
• 参考文献67-72
• 攻读学位期间发表的学术论文72-73
• 致谢73

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