甘草离体培养条件优化及转HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根培养体系的构建

发布时间：2017-08-29 08:21

  本文关键词：甘草离体培养条件优化及转HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根培养体系的构建

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【摘要】：甘草是我国最常用的大宗药材之一,具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛和调和诸药等作用。但是近些年来人工栽培甘草的质量差异较大,存在着品质退化和甘草酸含量低等问题,难以达到《中国药典》规定的标准。为了解决甘草资源可持续发展以及甘草酸药源匮乏等问题,甘草组织培养的相关研究受到了越来越多的重视。本论文试图从甘草再生植株、原生质体以及毛状根三个方面对甘草的离体培养进行研究,通过确定最佳的甘草再生植株诱导方案、甘草原生质体分离条件以及甘草毛状根诱导条件来建立完整的甘草组织培养体系,以期为基因工程研究及代谢工程研究奠定基础。此外,在确定了最佳甘草毛状根诱导条件的基础上,本论文进一步尝试了转基因甘草毛状根的诱导及培养,以甘草酸代谢途径上的三个关键酶基因：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)基因、鲨稀合成酶(squalene synthetase,SQS)基因以及β-香树脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因为目标基因,诱导根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因的甘草毛状根,不仅为进一步揭示甘草酸合成途径的分子调控机制奠定理论基础,也为离体条件下提高甘草酸的积累水平奠定研究基础。本论文共取得了如下研究结果：(1)建立了最佳的甘草离体培养再生体系,即：诱导培养基(MS+6.BA 0.5 mg·L-1 +2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1)、分化培养基(MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1)及生根培养基(1/2MS+IAA 0.6mg·L-1)。(2)确定了最佳的甘草原生质体分离条件,即：以生长7 d甘草无菌苗的子叶为外植体材料,在4℃条件下于MS基本培养基上预培养12 h；以含有0.7 mol·L-1甘露醇作为渗透保护剂的CPW溶液进行酶液(1.5%纤维素酶+0.5%果胶酶)的配制；在25℃条件下静置酶解14 h。(3)从是否预培养、是否添加AS、外植体来源以及培养基类型4个方面对甘草毛状根的诱导条件进行了研究,并确定了最佳的诱导方案,即：以甘草胚轴为外植体,以6,7-V培养基作为基本培养基,且无需预培养,无需添加AS。(4)成功构建了根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因发根农杆菌工程菌并成功诱导得到根特异性过表达HMGR、SQS1、α-AS基因甘草毛状根。(5)利用Real time PCR检测了11份根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因甘草毛状根中各外源基因拷贝数,结果显示过表达ê-AS基因毛状根中ê-AS基因拷贝数为3、4或7个,过表达HMGR基因毛状根中HMGR基因拷贝数为3或5个,过表达SQS1基因毛状根中SQS1基因拷贝数为5或6个。(6)利用HPLC检测了35份毛状根样品,其中24份空白毛状根以及全部的根特异性过表达HMGR及SQS1基因毛状根样品中均未检出甘草酸,仅在3份根特异性过表达ê-AS基因的毛状根B1、B2及B3中检出甘草酸,从而证实了ê-AS基因相比于HMGR、 SQS1基因对甘草酸合成的影响更为直接。
【关键词】：甘草 甘草酸 再生植株 原生质体 毛状根 根特异性过表达 HMGR SQS1 β-AS
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.71
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 英文缩略语10-11
• 前言11-15
• 1 立题依据11-12
• 1.1 栽培甘草品质降低成为制约甘草资源可持续发展的关键问题11
• 1.2 甘草组织培养技术有利于解决甘草资源可持续发展这一瓶颈问题11
• 1.3 毛状根在次生代谢产物合成方面具有重要价值11
• 1.4 功能基因对甘草酸生物合成具有明确的影响11-12
• 2 研究思路与方法12-15
• 2.1 研究目标12
• 2.2 研究内容12-14
• 2.3 技术路线14-15
• 第一章 文献综述15-21
• 1 甘草离体培养研究进展15-19
• 1.1 外植体材料15-16
• 1.2 愈伤组织诱导16
• 1.3 再生植株诱导16-17
• 1.4 原生质体培养17-18
• 1.5 甘草毛状根的诱导及培养18-19
• 2 甘草酸代谢途径功能基因的研究概况19-21
• 2.1 3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因20
• 2.2 鲨烯合酶基因20
• 2.3 β-香树脂醇合成酶基因20-21
• 第二章 甘草离体培养再生体系的建立21-31
• 1 材料与方法21-26
• 1.1 实验材料21-24
• 1.2 甘草外植体材料制备24
• 1.3 甘草愈伤组织诱导24-25
• 1.4 分化培养25
• 1.5 生根培养25
• 1.6 甘草再生植株炼苗及移栽25-26
• 2 结果26-30
• 2.1 甘草外植体制备26-27
• 2.2 甘草愈伤组织诱导27-28
• 2.3 甘草再生植株诱导28-29
• 2.4 甘草再生植株炼苗及移栽29-30
• 3 小结与讨论30-31
• 第三章 甘草原生质体分离条件优化31-37
• 1 材料与方法31-34
• 1.1 实验材料31-32
• 1.2 不同酶液组合及外植体材料对甘草原生质体分离的影响32-33
• 1.3 不同酶解时间以及酶解方式对甘草原生质体分离的影响33
• 1.4 不同低温预处理方法对甘草原生质体分离的影响33
• 1.5 不同渗透压对甘草原生质体分离的影响33-34
• 1.6 甘草原生质体产量和活力的计算方法34
• 2 结果34-36
• 2.1 不同酶液组合及供试材料处理结果34
• 2.2 不同酶解时间以及酶解方式对甘草原生质体分离的影响34-35
• 2.3 不同低温预处理方法对甘草原生质体分离的影响35-36
• 2.4 不同渗透压对甘草原生质体分离的影响36
• 3 小结与讨论36-37
• 第四章 甘草毛状根诱导条件优化37-46
• 1 材料与方法37-41
• 1.1 实验材料37-39
• 1.2 发根农杆菌的活化39
• 1.3 甘草外植体材料制备39
• 1.4 毛状根诱导条件变量设计39
• 1.5 侵染、共培养及除菌39-40
• 1.6 甘草毛状根的PCR验证及测序验证40-41
• 2 结果41-45
• 2.1 发根农杆菌的活化41
• 2.2 各实验组毛状根诱导情况比较41-44
• 2.3 毛状根PCR验证及测序验证结果44-45
• 3 小结与讨论45-46
• 3.1 小结45
• 3.2 讨论45-46
• 第五章 甘草根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根的诱导与分析46-71
• 1 材料与方法46-55
• 1.1 实验材料46-47
• 1.2 根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因发根农杆菌工程菌的构建47-50
• 1.3 甘草根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根的诱导及培养50-51
• 1.4 根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因甘草毛状根中各目的基因拷贝数测定51-54
• 1.5 HPLC法测定转基因甘草毛状根中甘草酸含量54-55
• 2 结果55-69
• 2.1 发根农杆菌工程菌PCR及测序验证结果55-57
• 2.2 甘草根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根的诱导及培养57-61
• 2.3 根特异性过表达HMGR、SQS1、β-AS基因毛状根中各外源基因拷贝数测定结果61-68
• 2.4 HPLC测定甘草毛状根中甘草酸含量结果68-69
• 3 小结与讨论69-71
• 3.1 小结69-70
• 3.2 讨论70-71
• 第六章 总结与展望71-73
• 1 总结71-72
• 2 展望72-73
• 参考文献73-78
• 致谢78-79
• 在学期间主要研究成果79

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本文编号：752269