锌对土壤菌群及抗生素抗性水平转移有关基因的影响

发布时间：2017-09-01 06:36

  本文关键词：锌对土壤菌群及抗生素抗性水平转移有关基因的影响

  更多相关文章： 锌 水平基因转移 耐药性 可移动遗传元件 Miseq高通量测序 实时荧光定量PCR

【摘要】：抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)作为一种新型环境污染物,主要存在于微生物体内或裸露在外,它不仅可以在环境中持久性残留,而且还可以通过水平迁移在不同环境介质中传播、扩散,产生潜在生态危害。土壤作为一种重要的环境介质,其中的重金属和抗生素复合污染现象日趋严重,因此有必要对土壤环境中的抗生素抗性菌、抗性基因及可移动遗传元件对重金属的响应特征进行探究。本文针对土壤重金属驱动抗生素抗性基因水平转移传播的现象,在实验室条件下,向采集于国家种质镇江桑树圃的土壤中喷施不同浓度的硫酸锌溶液,处理不同时间后取样分析。Miseq高通量测序结果表明,高浓度的重金属锌对土壤长时间处理会降低土壤微生物的多样性和丰度,但在一定程度上能够促进抗性优势菌群的生长繁殖。不同浓度重金属锌处理的土壤样品中,门水平上的物种类别差异不大,变形菌门(Proteobacteria)是所有样品中的主要优势门类;在属水平上,不同样品所含的物种类别差异较大,但Flavisolibacter,芽单胞菌属(Gemmatimonas),Gp4,Gp6为共同的优势属类。聚类分析发现,大多数重金属锌浓度相近的样品之间微生物群落结构相似度较高,但也有例外,比如重金属锌浓度为100和1000 mg/kg处理2个月的样品2(100)和2(1000)相似度高于0.6。综合分析表明,锌离子浓度对土壤微生物群落结构的影响要大于处理时间对微生物群落结构的影响。利用抗生素选择性培养基筛选法,从样品中分离筛选出7株不同的抗生素抗性菌(分别命名为:C1、STZ2、S3、N2、G1、G2、G5),经鉴定抗性菌C1、G2属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.),N2、G1属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),S3属于短波单胞菌属(Brevundimonas sp.),STZ2属于卡斯特兰尼氏菌属(Castellaniella sp.),G5属于节杆菌属(Arthrobactor sp.)。七种抗生素药敏试验结果表明,7株菌均有多重耐药性和不同程度的重金属锌与抗生素交叉抗性;锌离子与抗生素之间的相互作用(协同抗性或是协同杀菌)不仅与重金属锌的浓度有关,而且与抗生素和细菌的种类也有关系。庆大霉素和新霉素与50~150 mg/kg的重金属锌共存时,对细菌STZ2和C1的生长曲线的影响主要表现为菌株的适应期延长,对数期延后,稳定期生长量减少。利用实时荧光定量PCR技术对土壤中包括氨基糖苷类抗性基因,可移动遗传元件转座子和Ⅰ类整合子的21个基因在内的丰度进行相对定量,发现氨基糖苷类抗性基因aacA/aphD,aac(6')-Iy,aac(6')-II,spcN,转座酶基因tnpA和整合子基因int11均在重金属锌浓度为800和1000 mg/kg时基因丰度明显上升,整合酶基因int11的丰度最高可达对照的1851倍。结果表明,环境中高浓度的重金属锌与氨基糖苷类抗性基因及可移动遗传元件转座子和整合子之间能够形成共选择作用,促使氨基糖苷类抗性基因与可移动遗传元件转座子和整合子的基因丰度上升,有利于可移动遗传元件介导的氨基糖苷类抗性基因的水平转移。以期为遏制氨基糖苷类抗生素抗性基因在土壤环境中的水平传播扩散提供重要的理论依据。
【关键词】：锌 水平基因转移 耐药性 可移动遗传元件 Miseq高通量测序 实时荧光定量PCR
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X53;X172
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第1章 绪论13-23
• 1.1 重金属污染的治理方法13
• 1.2 抗生素的种类和使用现状13-15
• 1.3 重金属和抗生素的复合污染15
• 1.4 土壤抗生素抗性基因的研究现状15-20
• 1.4.1 抗生素抗性基因与抗性基因水平转移机制15-17
• 1.4.2 土壤重金属对抗生素抗性基因的影响17
• 1.4.3 可移动遗传元件介导抗生素抗性基因的水平转移17-19
• 1.4.4 抗生素抗性基因的研究手段19-20
• 1.5 研究目的与内容20-23
• 1.5.1 研究目的20-21
• 1.5.2 研究内容21-23
• 第2章 重金属锌对土壤微生物多样性的影响23-33
• 2.1 土壤样品的前处理23
• 2.2 Miseq测序实验流程23-24
• 2.2.1 基因组DNA抽提23
• 2.2.2 PCR扩增23-24
• 2.2.3 荧光定量24
• 2.2.4 文库的建立及Miseq上机测序24
• 2.3 生物信息分析流程与内容24
• 2.4 结果与讨论24-31
• 2.4.1 原始数据24
• 2.4.2 数据去杂24-25
• 2.4.3 序列信息和多样性指数25-26
• 2.4.4 稀释曲线26-27
• 2.4.5 门水平上的分类情况27-28
• 2.4.6 属水平上的分类情况（heatmap）28-29
• 2.4.7 聚类分析(Cluster analysis)29-31
• 2.5 本章小结31-33
• 第3章 重金属锌对土壤微生物抗生素抗性水平的影响33-49
• 3.1 试验材料33-35
• 3.1.1 土样的来源33
• 3.1.2 主要试剂33-34
• 3.1.3 实验仪器34
• 3.1.4 培养基34-35
• 3.2 试验方法35-37
• 3.2.1 土样的处理35
• 3.2.2 土壤抗生素抗性菌的分离纯化与菌落计数35
• 3.2.3 菌落形态观察35
• 3.2.4 抗性菌株的鉴定35-36
• 3.2.5 抗性菌株的交叉耐药性测试36-37
• 3.3 结果与讨论37-48
• 3.3.1 土壤基础理化性质37
• 3.3.2 重金属锌对土壤微生物抗生素抗性菌的影响37-39
• 3.3.3 抗性菌的筛选与形态特征39-40
• 3.3.4 生理生化鉴定结果40-41
• 3.3.5 基于 16S rDNA基因序列的系统发育分析41-43
• 3.3.6 药敏试验结果43-46
• 3.3.7 抗生素与不同浓度Zn~(2+)交叉对抗性菌株C1和STZ2生长的影响46-48
• 3.4 本章小结48-49
• 第4章 重金属锌对土壤细菌抗性基因及可移动遗传元件丰度的影响49-61
• 4.1 试验材料49-50
• 4.1.1 实验试剂49
• 4.1.2 实验仪器49-50
• 4.2 试验方法50-51
• 4.2.1 土壤微生物核酸的提取50
• 4.2.2 抗生素抗性基因及可移动遗传元件丰度的检测50-51
• 4.2.3 数据统计与分析51
• 4.3 试验结果51-58
• 4.3.1 氨基糖苷类抗性基因的丰度变化51-54
• 4.3.2 可移动遗传元件的丰度变化54-58
• 4.4 本章讨论与小结58-61
• 结论61-63
• 参考文献63-71
• 攻读学位期间发表的学术论文71-73
• 致谢73-74
• 详细摘要74-78

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本文编号：770510