凡纳滨对虾mTOR信号通路中重要基因的克隆和功能的初步研究

发布时间：2017-09-02 01:01

  本文关键词：凡纳滨对虾mTOR信号通路中重要基因的克隆和功能的初步研究

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【摘要】：本研究通过对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行转录组测序,并结合模式生物中mTOR信号通路的已有研究结果,分析获得了33个可能参与凡纳滨对虾mTOR信号通路调控作用的基因片段。在此基础上,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆得到raptor、eif4e2和eif4e1a三个基因的cDNA序列。raptor基因cDNA序列全长5020 bp,开放阅读框3804 bp,编码1267个氨基酸残基;eif4e2基因cDNA序列全长1069 bp,开放阅读框699 bp,编码232个氨基酸残基;eif4e1a基因cDNA序列全长3579 bp,开放阅读框627 bp,编码208个氨基酸残基。氨基酸推断序列比对和进化分析均证实,凡纳滨对虾Raptor蛋白与其他已知Raptor蛋白为同源蛋白,eIF4E2和eIF4E1A为目前已知的eIF4E家族蛋白的同源蛋白。利用Realtime-PCR实时荧光定量的方法研究了tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五个基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达差异,结果表明:(1)凡纳滨对虾tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五个基因在眼柄、肝胰脏、肠道、胃、鳃丝和肌肉等组织中均有表达。(2)tor基因在肝胰脏、肌肉和眼柄中的表达量显著高于其在肠道、胃和鳃丝中的表达量(p0.05);在肝胰脏中表达量显著高于眼柄中的表达量,肝胰脏和肌肉中表达量之间没有显著差异,眼柄和肌肉中的表达量之间也没有显著差异;在肠道、胃和鳃丝中,tor基因表达量之间没有显著差异。(3)raptor基因在肝胰脏中表达量显著高于其他组织(p0.05),肠道、胃和肌肉中的表达量之间没有显著差异,但肠道中表达量显著高于眼柄和鳃丝(p0.05),同时眼柄、胃、鳃丝和肌肉中的表达量之间没有显著差异。(4)eif4ebp基因在肌肉中的表达量极显著高于其他组织(p0.01),鳃丝中表达量次之,在眼柄、肝胰脏、肠道和胃中的表达量之间没有显著差异且表达量都相对较少。(5)eif4e2基因在肌肉中的表达量显著高于其他组织,eif4e1a基因在肠道和肌肉中都有较高表达量,且在肠道中的表达量显著高于其在肌肉中的表达量(p0.05)。利用Realtime-PCR实时荧光定量的方法研究了注射雷帕霉素或氨基酸后肌肉中tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五个基因表达量的变化情况,探讨了tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五个基因在mTOR信号通路中的信号传递调控机制及其在细胞生长中的调控作用。研究结果表明:(1)注射雷帕霉素后2个小时内肌肉中tor、raptor、eif4e2和eif4e1a基因表达量都出现显著下降,eif4ebp基因表达量显著上升(p0.05),说明凡纳滨对虾mTOR信号通路对雷帕霉素敏感。(2)肌肉中tor和raptor基因的表达量在单独注射亮氨酸4个小时内均未出现变化;在注射精氨酸或者同时注射亮氨酸和精氨酸后,肌肉中tor和raptor基因的表达量均在半小时出现显著上升(p0.05)。(3)肌肉中eif4e1a基因的表达量在单独注射亮氨酸或精氨酸4个小时内均未出现变化,但在同时注射亮氨酸和精氨酸后表达量均显著增加(p0.05);肌肉中eif4e2基因在注射亮氨酸或精氨酸,以及同时注射亮氨酸和精氨酸后表达量都明显提高(p0.05),且同时注射亮氨酸和精氨酸后,基因表达变量明显比单独注射亮氨酸或精氨酸后变化量大。以上研究结果表明,氨基酸能够激活凡纳滨对虾mTOR信号通路中基因的转录表达,且与小鼠、斑马鱼等模式生物相似,凡纳滨对虾eif4e2和eif4e1a基因能够通过mTOR信号通路接收不同氨基酸信号来调控细胞生长。综上所述,凡纳滨对虾mTOR信号通路对雷帕霉素敏感,且可以接收氨基酸信号调控细胞生长。本研究首次克隆了凡纳滨对虾中参与mTOR信号通路的几个关键基因的全长cDNA序列,并对其功能进行了初步研究。不仅为mTOR信号通路的系统发生研究提供了参考,而且从分子水平了解对虾的生长和代谢调控机制,对于对虾饲料配方的优化也具有重要的意义。
【关键词】：凡纳滨对虾 mTOR 雷帕霉素 氨基酸
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;S917.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 绪论10-22
• 1.1 水产动物分子营养学的研究10-12
• 1.2 营养素调控和基因表达12
• 1.3 mTOR信号通路12-20
• 1.3.1 TOR蛋白12-13
• 1.3.2 mTOR信号通路参与调控的生命过程及调控机制13-16
• 1.3.3 水产动物mTOR信号通路的研究进展16-20
• 1.4 本研究的目的和意义20-22
• 第二章 实验材料与方法22-28
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 凡纳滨对虾22
• 2.1.2 基因克隆和实时荧光定量引物设计与合成22
• 2.1.3 仪器设备22-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 凡纳滨对虾总RNA的提取24
• 2.2.2 cDNA第一链的合成24-26
• 2.2.4 基因表达的组织分布26
• 2.2.5 雷帕霉素注射实验26-27
• 2.2.6 氨基酸注射实验27-28
• 第三章 实验结果28-48
• 3.1 凡纳滨对虾转录组测序分析28-29
• 3.2 基因全长cDNA的克隆29-40
• 3.2.1 肌肉总RNA的提取29-30
• 3.2.2 基因cDNA全长序列克隆30-37
• 3.2.3 蛋白质氨基酸序列的对比分析37-40
• 3.3 基因表达的组织分布40-42
• 3.3.1 SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系优化40
• 3.3.2 基因的组织表达分析40-42
• 3.4 基因应答雷帕霉素注射的表达分析42-45
• 3.5 基因应答氨基酸注射的表达分析45-48
• 第四章 研究讨论48-54
• 4.1 基因cDNA序列、氨基酸序列及结构特征分析48-49
• 4.1.1 raptor基因的cDNA序列和氨基酸序列的分析48
• 4.1.2 两个eif4e家族基因的cDNA序列和氨基酸序列的分析48-49
• 4.2 基因组织表达特征49-50
• 4.3 基因功能研究分析50-54
• 4.3.1 tor、raptor和eif4ebp基因的功能研究分析50-51
• 4.3.2 两个eIF4E家族基因的功能研究分析51-53
• 4.3.3 tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a之间的相互作用探讨53-54
• 第五章总结与展望54-56
• 5.1 研究总结54-55
• 5.2 研究展望55-56
• 参考文献56-66
• 致谢66-67
• 作者简历67-68
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文与研究成果68

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1 衣萌萌;于赫男;林小涛;许忠能;周小壮;;密度胁迫下凡纳滨对虾的行为与生理变化[J];暨南大学学报(自然科学与医学版);2012年01期

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本文编号：775417