曼氏无针乌贼雌激素受体基因的克

发布时间：2017-09-02 11:34

  本文关键词：曼氏无针乌贼雌激素受体基因的克隆、表达及生殖调控功能初探

  更多相关文章： 曼氏无针乌贼 雌激素受体 基因克隆 亚细胞定位 生殖调控

【摘要】：曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)是我国沿海海域最重要的海洋头足类物种,现人工养殖已经取得突破。但养殖过程中普遍出现的性早熟现象严重影响其养殖效果,因此揭示养殖条件下的乌贼生殖发育调控机制是解决这一问题的关键。雌激素受体(estrogen receptor,ER)是典型的性类固醇核受体,在许多海洋动物的性成熟和生殖发育中扮演着重要角色。鉴于ER可能也参与乌贼的生殖发育调控,本文首次开展了曼氏无针乌贼雌激素受体sjER基因克隆和序列特征分析、亚细胞定位和受体类型鉴定、可能作用位点及组织分布特征、在生殖周期中变动规律及在生殖发育中的调控功能等方面的研究。主要取得的研究结果如下:采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术构建了曼氏无针乌贼未成熟和成熟卵巢转录表达谱数据库,经去冗余处理和拼接处理后,共计获得70,039条Unigenes,均长800 bp,40.7%(28,492)Unigene获得注释信息,其中近38.5%(10,969)Unigene获得GO分类注释。筛选获得了一批性腺发育相关基因序列,未成熟卵巢转录组中有793条高丰富表达(FPKM≥100)基因,成熟卵巢转录组中找到38条高丰富表达基因。成熟与未成熟阶段卵巢转录组相比,基因表达显著下调(P0.001)基因为46,071个,显著上调基因为1,217个,其中ER在卵巢成熟阶段基因表达量显著上调,注释的ER基因序列与章鱼的ER基因序列同源性高达80%以上。采用5'和3'RACE技术获得了sjER的全长序列,并对其序列特征进行了分析,结果表明,sjER cDNA序列(KT278504)全长1,788 bp,包含280 bp的5'UTR,38 bp的3'UTR和1,470 bp的ORF,可编码489个氨基酸。与其他核受体结构一样,sjER可分为:A/B区(N端,130aa),C区(DNA结合区DBD,80aa),D区(铰链区,35aa)、E区(配体结合区LBD,228aa)和F区(C端,16aa)。C区和E区高度保守,和真蛸ER相似性高达100%和96%。ER系统进化分析发现,动物中雌激素受体明显分为三支:脊椎动物雌激素受体(ERα、ERβ和ERγ),头索动物雌激素受体和无脊椎动物雌激素受体。sjER和软体动物聚为一支,与头足类真蛸ER同源性高达89%。对sjER受体性质及定位进行分析,结果表明,通过构建sjER-EGFP表达载体,转染至HEK293细胞中,用荧光染料DiI染膜、DAPI染核,在激光共聚焦显微镜下观察发现绿色荧光主要定位在核上,确定sjER定位于细胞核上,与sjER序列中存在两个核定位信号NLS的预测结果相一致,表明sjER是一个核受体,可能通过配体依赖激活特定基因转录行使功能。对sjER表达的组织特异性及其随性腺发育的波动规律进行研究,结果表明,荧光定量PCR方法检测出sj ER基因在曼氏无针乌贼雌性和雄性不同组织器官中广泛表达,在脑、性腺和肝等生殖发育相关组织中有较高的表达量,在其他组织中表达量相对较低。sjER的表达在乌贼的生殖发育周期中有明显的波动,在卵子发生的卵原细胞阶段,原生质生长阶段和间质生长阶段,sjER表达量随卵子发生的推进而显著上升(P0.05),到发育成熟阶段即营养质生长阶段sjER表达量则显著下降。乌贼生殖发育中sjER表达量变化与我们测定的卵巢中E2含量的变化趋势一致,说明ER在头足类性腺发育和成熟过程中可能扮演着重要角色。为探讨sjER究竟如何行使乌贼生殖发育的调控功能,我们将ERE-pGL3和sjER-Flag共转染到HEK293细胞中,研究雌激素和sjER是否通过雌激素反应原件ERE的激活来行使核受体功能。结果表明,sjER-Flag的转染能显著促进ERE表达量的成倍增加(P0.05),该促进作用可被ER的特异性抑制剂Tamoxifen显著抑制(P0.05),说明sjER对乌贼生殖发育的调控可能是通过sjER促进相关靶基因的ERE转录这一经典核受体途径来实现的。但添加17β-雌二醇(E2)并不能显著提高sjER对ERE的激活作用(P0.05),可能说明sjER的转录激活作用不依赖于sjER与配体E2的结合,而是依赖类似于其它软体动物ERs那样的自激活作用。在Ca2+流和cAMP测定实验中,E2的添加未能诱导sjER-Flag转染的HEK293细胞胞内出现cAMP和Ca2+第二信使,表明sjER可能并不能像许多高等动物ER那样通过与膜受体的相互作用介导膜信号转导途径。本论文的研究结果对于今后进一步阐明曼氏无针乌贼等头足类的生殖发育调控机制,掌握类固醇激素对头足类及软体动物性成熟的影响奠定基础。同时,也为揭示曼氏无针乌贼等海洋头足类人工养殖下的性早熟原理提供一定的理论基础。
【关键词】：曼氏无针乌贼 雌激素受体 基因克隆 亚细胞定位 生殖调控
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-15
• 引言15-17
• 第一章 雌激素及其受体研究综述17-23
• 1.1 雌激素在动物生殖发育中的调控作用17-18
• 1.2 雌激素受体ER介导雌激素生殖调控功能的信号传递途径18-20
• 1.3 雌激素及其受体在海洋无脊椎动物中的研究进展20-23
• 1.3.1 雌激素在海洋无脊椎动物中的研究进展20-21
• 1.3.2 雌激素受体在海洋无脊椎动物中的研究进展21-23
• 第二章 基于转录组的曼氏无针乌贼生殖发育相关功能基因数据挖掘及雌激素受体ER基因解析23-31
• 2.1 材料与方法23-25
• 2.1.1 实验材料23-25
• 2.1.2 总RNA提取25
• 2.1.3 转录组文库构建和测序25
• 2.1.4 数据分析和挖掘25
• 2.2 结果与分析25-29
• 2.2.1 转录组测序结果统计25-28
• 2.2.2 unigene表达差异分析28
• 2.2.3 雌激素受体ER基因的数据挖掘和解析28-29
• 2.3 讨论29-31
• 第三章 曼氏无针乌贼雌激素受体ER基因全序列的克隆和特征分析31-44
• 3.1 材料与方法31-37
• 3.1.1 实验材料31-32
• 3.1.2 总RNA提取32
• 3.1.3 获取sjER cDNA基因全长32-37
• 3.2 结果与分析37-42
• 3.2.1 RNA提取结果37-38
• 3.2.2 sjER cDNA基因扩增结果38
• 3.2.3 sjER cDNA基因全长序列的分析38-39
• 3.2.4 ER氨基酸同源序列分析39-40
• 3.2.5 ER系统发育分析40-42
• 3.3 讨论42-44
• 第四章 曼氏无针乌贼雌激素受体的亚细胞定位和受体类型鉴定44-50
• 4.1 材料与方法44-47
• 4.1.1 实验材料44-45
• 4.1.2 sjER-EGFP载体的构建45-46
• 4.1.3 HEK293细胞培养、冻存和复苏46
• 4.1.4 细胞转染46-47
• 4.1.5 荧光染料核染和膜染47
• 4.2 结果与分析47-48
• 4.2.1 sjER-EGFP表达载体的构建47
• 4.2.2 sjER在细胞中的定位47-48
• 4.3 讨论48-50
• 第五章 雌激素受体ER在曼氏无针乌贼生殖轴中的分布及在性发育周期中的变动规律研究50-59
• 5.1 材料与方法50-55
• 5.1.1 实验材料50-51
• 5.1.2 卵巢组织学观测51-53
• 5.1.3 不同组织总RNA提取53
• 5.1.4 cDNA模板合成53
• 5.1.5 实时荧光定量PCR53-54
• 5.1.6 性类固醇激素雌二醇E2浓度测定54-55
• 5.2 结果与分析55-56
• 5.2.1 sjER在曼氏无针乌贼生殖轴中的分布55
• 5.2.2 sjER及雌激素E2在曼氏无针乌贼生殖周期中的协同变动规律55-56
• 5.3 讨论56-59
• 5.3.1 sjER在曼氏无针乌贼生殖轴中的分布56-57
• 5.3.2 sjER在曼氏无针乌贼生殖周期中的变动规律及其与雌激素的关系57-59
• 第六章 曼氏无针乌贼雌激素受体ER介导的细胞信号转导功能初探59-68
• 6.1 材料与方法59-63
• 6.1.1 实验仪器59-60
• 6.1.2 实验试剂60
• 6.1.3 实验耗材60
• 6.1.4 ERE-pGL3载体的构建60-61
• 6.1.5 Flag-sjER61-62
• 6.1.6 HEK293细胞培养、冻存和复苏62
• 6.1.7 细胞转染62
• 6.1.8 ERE-pGL3含量检测62
• 6.1.9 Ca~(2+)流检测62
• 6.1.10 cAMP含量检测62-63
• 6.2 结果与分析63-65
• 6.2.1 曼氏无针乌贼雌激素受体激活ERE靶基因的作用特性分析63
• 6.2.2 Ca~(2+)检测63-64
• 6.2.3 cAMP检测64-65
• 6.3 讨论65-68
• 6.3.1 曼氏无针乌贼雌激素受体激活ERE靶基因的作用特性分析65-66
• 6.3.2 雌激素受体介导的cAMP信号途径及Ca~(2+)流的检测66-68
• 参考文献68-77
• 致谢77-78
• 在读期间发表的学术论文及研究成果78

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