抗冷基因ZmRLK克隆，功能分析及对玉米遗传转化的研究

发布时间：2017-09-03 14:29

  本文关键词：抗冷基因ZmRLK克隆，，功能分析及对玉米遗传转化的研究

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【摘要】：玉米是世界上种植最为广泛的农作物之一,需求量在不断增长。因此提高玉米产量十分重要。而玉米产量受诸多生物及非生物胁迫影响,其中低温胁迫是东北地区比较普遍的农业气象灾害,在玉米生长季节,遇低温冷害,会导致叶片失水萎蔫,光合作用降低,花粉活力减弱,影响玉米的产量。因此,创制抗冷玉米新种质和培育玉米新品种就显得尤为重要。本研究利用RACE技术,以W9816为实验材料克隆抗冷基因Zm RLK,构建表达载体并转化拟南芥进行功能验证。同时以玉米骨干自交系Y423为实验材料,对农杆菌介导的玉米遗传转化体系进行优化,并采用农杆菌介导法及花粉管通道法将抗冷基因Zm RLK转入玉米基因组,获得抗冷玉米新种质。具体研究内容及结果如下:1.通过RACE(Rapid Amplification of c DNA Ends)技术克隆到完整的玉米抗冷基因Zm RLK的全长。测序结果表明:该基因的核苷酸序列为2028 bp,编码675个氨基酸,分子量为166.4471 k Da,等电点为4.91。对Zm RLK的氨基酸序列进行生物信息学分析表明,其与高粱,谷子等的相似性达到80%以上。由此可见Zm RLK编码一类进化保守性蛋白。2.以p CAMBIA3301为基础载体,分别以35S和UBI为启动子,成功构建了抗冷基因Zm RLK的植物过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK和干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)。3.将抗冷基因Zm RLK转化拟南芥并进行功能验证,结果表明过表达Zm RLK能提高植株对冷胁迫的耐受能力。4.优化农杆菌介导的玉米遗传转化体系。结果表明:当重悬后菌液浓度为OD600=0.55时,侵染时间为25 min,AS浓度为100μmol/L时,转化效率最高。分化培养基中当NAA的浓度为0.5 mg/L、6-BA的浓度为0.5 mg/L时,转化再生率最高。5.农杆菌介导的玉米遗传转化(1)以玉米骨干自交系Y423幼胚为受体,利用农杆菌介导法侵染12000个幼胚。其中过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK共侵染了6000个幼胚,经3 mg/L双丙氨膦筛选愈伤后,分化成苗2207株,分子检测获得89株阳性植株,转化率为4.0%;干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了4000个,筛选后分化成苗1845株,获得121株阳性植株,转化率为6.6%;空载体侵染2000个,筛选后分化成苗693株,获得31株阳性植株,转化率为4.5%。(2)以玉米骨干自交系Y423体细胞胚胎[1]为受体,利用农杆菌介导法侵染了12000块愈伤组织。其中过表达载体p CAMBIA3301-35S-Zm RLK侵染了7200块,经双丙氨膦筛选愈伤,分化成苗946株,分子检测获得63株阳性植株,转化率为6.7%;干扰载体p CAMBIA3301-UBI-Zm RLK(+)-intron-Zm RLK(-)侵染了3800块,分化成苗343株,获得20株阳性植株,转化率为5.8%;空载体侵染了1000块,分化成苗103株,获得8株阳性植株,转化率为7.8%。6.通过花粉管通道法将含有抗冷基因Zm RLK的表达载体转入玉米骨干自交系郑58、昌7-2。收获T0代植株共75穗,得到12530粒种子。其中过表达载体30穗,共5221粒;干扰载体27穗,共4706粒;空载体18穗,共2603粒。经过田间2‰浓度的Basta筛选及分子检测,获得68株阳性植株,其中过表达载体27株,干扰载体21株,空载体20株,转化率分别为0.52%,0.45%,0.77%。将T0代种子自交,获得T1代种子。按照同样方法进行加代并检测,目前已获得T2代种子共2638粒。
【关键词】：玉米 Zm RLK基因 功能验证 农杆菌介导法 花粉管通道法 遗传转化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩写表10-15
• 第1章 文献综述15-24
• 1.1 冷胁迫对玉米的影响及抗冷基因的研究进展15-19
• 1.1.1 冷胁迫对玉米的影响15-16
• 1.1.2 抗冷基因及RLK的研究进展16-19
• 1.2 玉米转基因研究进展19-23
• 1.2.1 玉米转基因受体材料19-20
• 1.2.2 转基因的基本方法20-23
• 1.2.3 转基因技术的发展前景23
• 1.3 本研究的目的与意义23-24
• 第2章 ZmRLK的克隆、载体构建与生物信息学分析24-47
• 2.1 实验材料24-26
• 2.1.1 实验药品与试剂24
• 2.1.2 实验菌种与载体24-25
• 2.1.3 培养基25-26
• 2.2 实验仪器26
• 2.3 实验方法26-35
• 2.3.1 冷处理26
• 2.3.2 总RNA的提取26-27
• 2.3.3 c DNA的合成27-28
• 2.3.4 引物设计28-29
• 2.3.5 目的基因的克隆29
• 2.3.6 目的片段回收与连接p MD18-T载体29-31
• 2.3.7 大肠杆菌感受态细胞制备及转化31-32
• 2.3.8 质粒DNA的提取及分子鉴定32-34
• 2.3.9 测序34
• 2.3.10 植物表达载体构建34
• 2.3.11 农杆菌感受态细胞的制备34
• 2.3.12 农杆菌转化及鉴定34-35
• 2.4 结果与分析35-44
• 2.4.1 ZmRLK基因的克隆35-37
• 2.4.2 植物表达载体的构建37-38
• 2.4.3 大肠杆菌质粒转化农杆菌的鉴定38-39
• 2.4.4 生物信息学分析39-44
• 2.5 讨论44-45
• 2.5.1 抗冷基因ZmRLK44-45
• 2.5.2 表达载体的构建45
• 2.6 小结45-47
• 第3章 抗冷基因ZmRLK的功能验证47-61
• 3.1 实验材料47-48
• 3.1.1 菌种与载体47
• 3.1.2 实验药品及仪器47
• 3.1.3 培养基47-48
• 3.2 实验方法48-53
• 3.2.1 农杆菌侵染法转化拟南芥48-49
• 3.2.2 转化植株抗性筛选49
• 3.2.3 转基因植株的检测49-51
• 3.2.4 冷胁迫处理51
• 3.2.5 生理生化指标的测定51-53
• 3.3 结果与分析53-59
• 3.3.1 转基因拟南芥的筛选53
• 3.3.2 转基因拟南芥植株的分子鉴定53-56
• 3.3.3 冷处理56-57
• 3.3.4 生理生化指标的测定57-59
• 3.5 讨论59-60
• 3.5.1 抗冷相关的生理生化指标59-60
• 3.5.2 拟南芥的种子萌发60
• 3.6 小结60-61
• 第4章 ZmRLK基因对玉米的遗传转化61-82
• 4.1 实验材料61-62
• 4.1.1 受体材料61
• 4.1.2 菌株和植物表达载体61
• 4.1.3 实验试剂、药品和仪器61
• 4.1.4 培养基61-62
• 4.2 实验方法62-66
• 4.2.1 幼胚的获得62
• 4.2.2 体细胞胚胎的诱导62
• 4.2.3 农杆菌侵染玉米幼胚62-63
• 4.2.4 遗传转化体系的优化63-64
• 4.2.5 农杆菌侵染玉米体细胞胚胎64
• 4.2.6 DNA提取64
• 4.2.7 分子检测64
• 4.2.8 荧光定量检测64-66
• 4.3 结果与分析66-80
• 4.3.1 遗传转化体系的优化66-71
• 4.3.2 农杆菌介导的玉米遗传转化71-76
• 4.3.3 DNA提取76
• 4.3.4 PCR检测76-79
• 4.3.5 荧光定量PCR79-80
• 4.4 讨论80-81
• 4.5 小结81-82
• 第5章 花粉管通道法转化玉米的研究82-90
• 5.1 实验材料82
• 5.1.1 受体材料82
• 5.1.2 菌株和植物表达载体82
• 5.1.3 实验试剂、药品及仪器82
• 5.2 实验方法82-84
• 5.2.1 重组质粒DNA的制备82-83
• 5.2.2 重组质粒DNA的导入83-84
• 5.2.3 T0代转化植株的Basta抗性筛选84
• 5.2.4 T0代转化植株分子检测84
• 5.3 结果与分析84-89
• 5.3.1 重组质粒DNA的分子鉴定84-85
• 5.3.2 T0代转化植株的Basta抗性筛选85-86
• 5.3.3 T0代转化植株的PCR分子检测86-88
• 5.3.4 转基因种子的获得88-89
• 5.4 讨论89
• 5.5 小结89-90
• 第6章 全文结论90-91
• 参考文献91-100
• 作者简介100-101
• 致谢101-102

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1 李倩;抗冷基因ZmRLK克隆，功能分析及对玉米遗传转化的研究[D];吉林大学;2016年

本文编号：785561