野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及抗寒相关功能分析

发布时间：2017-09-03 18:09

  本文关键词：野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及抗寒相关功能分析

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【摘要】：芭蕉属(Musa)植物,是热带亚热带植物,常作为重要观叶植物广泛应用于园林绿化及景观布置。但是由于芭蕉属植物多数容易受低温伤害,极大限制了其种植区域,并且低温易造成芭蕉叶片干枯黄化、水渍化,大大降低其观赏性。因此提高芭蕉的抗寒能力,能够丰富其在园林景观上的应用并提高观赏价值。本试验确定了10种芭蕉属植物资源的低温半致死温度,并测定了三明野生蕉的耐受低温及β-1,3葡聚糖酶活性变化;基于香蕉基因组数据库对β-1,3葡聚糖酶基因(GSP)家族进行功能及进化分析；克隆获得与抗寒相关的三明野生蕉Mugsps,并分析Mugsps的亚细胞定位和实时荧光定量表达情况。主要研究如下：1芭蕉属植物低温下的生理生化研究1.1低温下芭蕉属植物的电解质渗出率为比较芭蕉属植物间的抗寒性差异,本试验选取10种福建省芭蕉属植物种质,采用相对电导率法,测定低温下植株叶片的电解质渗出率,计算半致死温度,并以抗寒性最强的三明野生蕉为材料,测定其能够耐受的最低温度。①以10种芭蕉属植物的叶片为材料,设置处理温度为28℃、1℃、0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃,处理时间为36 h。使用Logistic方程计算低温半致死温度(LT5o)。结果显示10种芭蕉属植物种质电解质渗出率呈现“S”型变化,计算出的半致死温度由高到低为：血蕉(-0.377℃)、北蕉(-0.477℃)、天宝蕉(-0.739℃)、福州野生蕉(-1.086℃)、本地粉蕉(-1.187℃)、柴蕉(-1.204℃)、孟加拉蕉(.1.307℃)、三叠井蕉(-1.389℃)、澳洲粉蕉(-1.559℃)、三明野生蕉(-1.776℃),抗寒总体趋势为野生蕉高于栽培蕉,试验的结果为不同气候地区选择适宜种植的观赏芭蕉植物提供参考。②以三明野生蕉植株叶片为材料,测定其在0℃低温下处理Oh、1 h、4h、8h、12h、 24 h、5d、10d、15 d的电解质渗出率。结果显示,随着处理时间的延长,三明野生蕉叶片电解质渗出率呈现波浪型上升的趋势,在处理4h及24 h时电解质渗出率降低,分别为23.68%(低于对照24.81%)及25.34%,说明三明野生蕉在0℃处理下经历了两次抗寒响应过程,在处理4h时三明野生蕉启动了第一次抗寒响应,即时保护了细胞膜结构,阻止胞内物质外渗,使得电解质渗出率低于对照,随着处理时间延长,细胞组织不断受到低温破坏,在处理24 h时再次响应低温胁迫,通过产生抗寒相关功能蛋白、渗透调节物质及膜脂保护酶等调节低温下的细胞生理状态,使得处理5d后叶片电解质渗出率稳定在27%左右,说明三明野生蕉经过一段时间的低温适应,已经能够耐受0℃胁迫。1.2低温下三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶活性变化采摘三明野生蕉植株新叶于13℃、8℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃下处理36h,提取粗酶液,以昆布多糖为反应底物,采用DNS法测定还原糖生成量。结果表明,在13℃芭蕉属植物的低温临界生长温度下,β-1,3葡聚糖酶活性升高为对照的1.2倍,随着处理温度的降低,β-1,3葡聚糖酶活性呈现“先降低后升高再降低”的表现趋势,在三明野生蕉半致死温度附近(-2℃)达到酶活性高峰,为对照的1.4倍。试验结果说明,低温能够刺激β-1,3葡聚糖酶在植物响应低温胁迫的几个关键温度提高酶活性,是植物的低温保护酶。2基于香蕉基因组数据库的GSP全基因家族功能与进化分析植物β-1,3葡聚糖酶(EC.3.2.1.39)属于糖基水解酶酶第17家族,家族成员数量众多,功能复杂。本试验利用隐马尔科夫模型根据GSP特征结构域(Pfam:PF00332)重新搜索本地香蕉基因组(尖叶蕉与长梗蕉)数据库,获得65条尖叶蕉(M.acuminata)GSPs,剔除尖叶蕉基因组数据库中不含有GSP特征结构域的序列30条,增加未注释的GSP序列2条；获得69条长梗蕉(M.balbisiana)GSPs,剔除长梗蕉基因组数据库中不含有GSP特征结构域序列23条,增加未注释的GSP序列9条。构建尖叶蕉与拟南芥GSP家族基因的系统进化树发现,尖叶蕉GSP基因家族可分为α(α1、α2、α3)、β(β1、β2、β3)、γ三大类,α与γ类主要参与植物生长发育,p类具有PR功能。长梗蕉与尖叶蕉的系统进化树表明,除了长梗蕉“ITC1587 Bchr2 P03966"基因与其他GSP成员的相似性较低独自归为一类6以外,其余基因均能找到直系同源序列或是相似性很高,说明GSP家族基因功能在两个亚种中保存较完整。对尖叶蕉GSP家族基因的染色体定位分析表明GSP分布于2-11号染色体,不具有串联重复序列。研究表明芭蕉科植物经历了三次自身全家族基因复制事件,计算尖叶蕉20对GSPs旁系同源基因对Ka/Ks值均小于1,推测GSP家族基因在基因组复制事件后的净化选择起着主要作用。3野生蕉抗寒相关Mugsps的克隆分析以三明野生蕉组培苗为材料,利用RT-PCR和RACE技术,以合成的经13℃处理36 h的叶片cDNA为模板,采用同源克隆法获得5条β-1,3葡聚糖酶的cDNA及DNA序列,分别命名为Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4、Mugsp5。序列分析表明：Mugsp1.2、Mugsp2、 Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5均属于β1类p-1,3葡聚糖酶基因,cDNA的ORF长度分别为1020、1047、999、1023和960 bp,分别编码339、348、332、340和319个氨基酸。Mugsp1.2. Mugsp2、Mugsp4均含有1个内含子,而Mugsp3、MHgsp5不具有内含子结构,这与尖叶蕉和长梗蕉基因组上的同源基因结构差异较大,将Mugsp1.2同前人克隆获得的Mugsp(915 bp)和Mugsp1(951 bp)序列比较发现Mugsp1.2、Mugsp、Mugsp1是来自于同一基因的不同转录本,但是只有Mugsp1.2符合GT-AG内含子剪切规则,为该基因的正常转录本,而Augsp、 Mugsp1则是外显子缺失型的可变剪接体。生物信息学预测表明：除了Mugsp5以外,Mugsp1.2、 Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4均具有N端信号肽。Mugsp1.2、Mugsp4编码碱性β-1,3葡聚糖酶,含有一个跨膜结构域；Mugsp2、Mugsp3、Mugsp5编码酸性β-1,3葡聚糖酶,不具有跨膜结构域；5条Mugsps均含有MAPK等多个磷酸化位点,不含有X8、GPI锚定结构域、CTPP结构域及核定位信号。因此推测Mugsp1.2、Mugsp4属于Ⅱ型跨膜蛋白,而Mugsp2、Mugsp3、 Mugsp5属于膜周边蛋白,Mugsps(Mugspl.2-Mugsp5)可能属于一类新的PR相关p-1,3葡聚糖酶基因,并参与了MAPK抗寒调控途径。4野生蕉抗寒相关Mugsps的亚细胞定位分析为探究Mugsps在低温下的作用机制,本试验对克隆获得的其中3个β-1,3葡聚糖酶基因(Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4)进行了常温及低温下的亚细胞定位观察。将Mugspl.2、Mugsp2、 Mugsp4的完整ORF序列同PCAMBIA1302-GFP构建融合蛋白表达载体,获得35S-Mugsp1.2-GFP、35S-Mugsp2-GFP、35S-Mugsp4-GFP重组质粒,采用农杆菌介导法侵染洋葱表皮细胞,将侵染的洋葱表皮材料,一部分置于常温培养后使用共聚焦成像仪观察亚细胞定位,另一部分转移到8℃低温下继续培养后,使用1 μg/mLDAPI染色后再进行亚细胞定位观察。观察结果表明：常温下Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP、Mugsp4-GFP蛋白主要分布在细胞膜、细胞质上,GFP空载体蛋白在细胞核、细胞质、细胞膜、细胞间隙处均有分布,8℃低温处理后Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP、Mugsp4-GPF融合表达载体的绿色荧光信号除了分布在液泡膜、细胞膜和细胞质外,还分布在细胞核。推测低温下膜蛋白Mugspl.2、 Mugsp2、Mugsp4感受低温信号后,通过结合某些钙调蛋白或者通过磷酸化作用,将抗寒信号传递至细胞核,调控转录因子及下游功能基因的表达。5野生蕉抗寒相关Mugsps低温处理下的荧光定量表达分析为进一步研究Mugsps在低温下的抗寒机理,本试验以三明野生蕉组培苗为材料,以18s为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术检测Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、 Mugsp4、Mugsp5 7个基因在低温下的表达情况。试验结果表明：①在28℃、20℃、13℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃不同温度处理36h下：随着处理温度的降低,Mugsps均能响应低温胁迫改变表达量,但是成员间的表达水平存在差异：Mugsp2表现为“先升高后降低”的趋势,只有一个表达高峰,在4℃时表达量最高,为常温对照的3.5倍,其余基因(Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp3、Mugsp4、Mugsp5)则呈现“M”型的表达趋势,有两个表达高峰,其中Mugsp、Mugspl.2、Mugsp5分别在13℃及4℃时达到表达高峰,表达量为常温的1.7、2.1、0.8及2.5、2.2、1.4倍左右,而Mugsp1、 Mugsp3、Mugsp4在13℃及0℃表达量达到最高,分别为常温的2.0、0.8、0.6及2.7、5.0、4.5倍左右。总体上,Mugsp1、Mugsp1.2、Mugsp3对温度变化响应剧烈,表达量较高,推测起着更关键的抗寒作用。定量结果与不同温度下β-1,3葡聚糖酶活性的表现趋势基本一致,说明低温下Augsps能够协同翻译成β-1,3葡聚糖酶协助植株抵抗低温胁迫。②常温28℃、8℃及8℃低温下喷施0.5 mmol/L SA分别进行1h、4h、8h、12h、 24 h处理后：8℃低温下,Mugsps均能相继在1-4h内提高表达量,其中Mugsp、Mugsp1、 Mugsp1.2在低温处理1h时达到表达高峰,而Mugsp2、Mugsp4、Mugsp5在处理4h时达到表达高峰,说明Mugsps能够快速响应低温胁迫,；8℃喷施SA处理则会推迟Mugsps的表达,使得Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2在处理12h时达到表达高峰,而此时Mugsp2、Mugsp4、 Mugsp5表达量才开始升高,并在24 h表达量显著提高,推测低温下Mugsps可能参与了抗寒传导途径早期的上游调控,而低温SA处理延缓了细胞膜受到的低温伤害,使得Mugsps因未能感受到膜变化而推迟表达。综上所述,三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因Mugsps在8℃低温刺激下,可能通过与MAPK的磷酸化作用作为抗寒途径的上游信号传导因子,在1-4 h短时间内迅速提高基因表达量,将抗寒信号快速从细胞膜传递至细胞核,起着抗寒传导途径中的早期调控作用,协助激活下游基因表达。试验结果为探究β-1,3葡聚糖酶极其基因在芭蕉属植物中的抗寒功能及作用机制,为提高芭蕉植物的抗寒性,研究植物的抗寒机理奠定了基础。
【关键词】：野生蕉 β-1 3葡聚糖酶 抗寒性 全基因家族分析 亚细胞定位 荧光定量表达
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.36
【目录】：

• 缩写词8-9
• 摘要9-13
• Abstract13-18
• 第一章 引言18-25
• 1 植物抗寒研究进展18-20
• 1.1 植物低温为害生理18-19
• 1.2 植物抗寒指标19
• 1.3 植物冷传导途径19-20
• 2 芭蕉属植物抗寒相关研究20-21
• 2.1 芭蕉属植物的低温为害生理20-21
• 2.2 芭蕉属植物低温伤害发生规律21
• 2.3 芭蕉属植物抗寒相关基因的研究21
• 3 植物β-1,3葡聚糖酶的研究进展21-23
• 3.1 β-1,3葡聚糖酶的功能21-22
• 3.2 β-1,3葡聚糖酶的分类22-23
• 4 本研究的意义及主要内容23-25
• 4.1 本研究的意义23-24
• 4.2 研究的主要内容24-25
• 第二章 芭蕉属植物低温下的生理生化研究25-37
• 第一节 低温下芭蕉属植物的电解质渗出率测定25-31
• 1 材料与方法25-26
• 1.1 材料25-26
• 1.2 方法26
• 1.2.1 低温预处理26
• 1.2.2 处理条件26
• 1.2.3 电导率测定26
• 1.2.4 半致死温度计算26
• 2 结果与分析26-29
• 2.1 低温胁迫下10种芭蕉属植物的相对电导率(REC)变化26-27
• 2.2 低温胁迫下10种芭蕉属植物的半致死温度(LT_(50))确定27-28
• 2.3 三明野生蕉的耐受低温确定28-29
• 3. 讨论29-31
• 3.1 芭蕉属植物的抗寒差异分析29-30
• 3.2 植物能够启动多次抗寒响应30
• 3.3 10种芭蕉属植物适宜种植的区域探讨30-31
• 第二节 低温下三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶活性变化31-37
• 1 材料与方法31-32
• 1.1 材料31
• 1.2 方法31-32
• 1.2.1 材料处理31
• 1.2.2 葡萄糖标准曲线制作31-32
• 1.2.3 粗酶液提取32
• 1.2.4 待测样品制备32
• 1.2.5 DNS法测定还原糖生成量32
• 2 结果与分析32-35
• 2.1 不同温度处理下三明野生蕉叶片表面变化32-33
• 2.2 不同温度处理下β-1,3葡聚糖酶活性变化33-35
• 3 讨论35-37
• 3.1 β-1,3葡聚糖酶在内的PR蛋白具有重要的抗寒功能35
• 3.2 β-1,3葡聚糖酶可能参与了植物的抗寒及抗冻响应35-37
• 第三章 基于香蕉基因组数据库的GSP全基因家族功能与进化分析37-53
• 1 材料与方法37-38
• 1.1 GSP家族基因成员获得与验证37
• 1.2 GSP系统进化树构建及基因结构分析37-38
• 1.3 GSP家族基因在染色体上的定位与基因复制事件推测38
• 2 结果与分析38-51
• 2.1 尖叶蕉与长梗蕉GSP家族基因序列的获得38-40
• 2.2 尖叶蕉GSP家族基因分类及功能分析40-41
• 2.3 尖叶蕉与长梗蕉GSP基因家族比较与进化分析41-48
• 2.4 尖叶蕉GSP家族基因的染色体定位与进化分析48-51
• 3 讨论51-53
• 3.1 GSP功能具有多样性和保守性51
• 3.2 GSP抗寒及PR相关功能可能来源于外源基因的插入51-53
• 第四章 野生蕉抗寒相关Mugsps的克隆分析53-63
• 1 材料与方法53-55
• 1.1 材料53
• 1.2 方法53-55
• 1.2.1 三明野生蕉总RNA提取及cDNA合成53
• 1.2.2 三明野生蕉DNA提取53-54
• 1.2.3 Mugsps的cDNA和DNA克隆及分析54-55
• 2 结果与分析55-60
• 2.1 三明野生蕉Mugsps的cDNA和DNA序列获得55-56
• 2.2 三明野生蕉、尖叶蕉及长梗蕉的β-1,3葡聚糖酶基因序列比对分析56-58
• 2.3 三明野生蕉Mugsps的生物信息学分析58-60
• 3 讨论60-63
• 3.1 Mugsps可变剪接参与植物抗寒60-61
• 3.2 Mugsps可能参与抗寒相关蛋白激酶MAPK调控途径61
• 3.3 Mugsps可能属于一类新的PR相关β-1,3葡聚糖酶基因61-63
• 第五章 野生蕉抗寒相关Mugsps的亚细胞定位分析63-69
• 1 材料与方法63-64
• 1.1 材料63
• 1.2 方法63-64
• 1.2.1 三明野生蕉总RNA的提取及cDNA合成63
• 1.2.2 引物设计与PCR扩增63-64
• 1.2.3 融合表达载体构建64
• 1.2.4 表达载体转化洋葱表皮细胞及显微观察64
• 2 结果与分析64-67
• 2.1 常温下Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的亚细胞定位64-66
• 2.2 低温诱导Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4定位改变66-67
• 3 讨论67-69
• 3.1 β-1,3葡聚糖酶的膜定位是行使多种功能的基础67
• 3.2 低温下Mugsps可能参与植物抗寒途径的上游调控67-69
• 第六章 野生蕉抗寒相关Mugsps的实时荧光定量表达分析69-76
• 1 材料与方法69-70
• 1.1 材料69
• 1.2 方法69-70
• 1.2.1 三明野生蕉材料处理及总RNA提取、cDNA合成69
• 1.2.2 实时荧光定量PCR引物设计69-70
• 1.2.3 荧光定量PCR扩增70
• 2 结果与分析70-74
• 2.1 不同温度处理下的三明野生蕉叶片形态变化70-71
• 2.2 不同低温处理下Mugsps表达分析71-72
• 2.3 低温及SA处理后Mugsps表达分析72-74
• 3 讨论74-76
• 3.1 Mugsps协同抵御植物低温胁迫74
• 3.2 低温下SA可能通过保护细胞膜推迟对Mugsps的诱导74-75
• 3.3 Mugsps可能作为植物抗寒途径的早期信号传导因子75-76
• 第七章 结论76-80
• 参考文献80-88
• 附录88-97
• 图版Ⅰ 三明野生蕉Mugsps的序列信息88-92
• 图版Ⅱ 三明野生蕉Mugsps生物信息学预测结果92-97
• 致谢97

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