刺参盐度相关基因的干扰及功能研究

发布时间：2017-09-03 20:31

  本文关键词：刺参盐度相关基因的干扰及功能研究

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【摘要】：刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的名贵海珍产品,随着刺参养殖规模不断的扩大,养殖刺参出现种质资源退化、抗病能力显著下降以及由水温和盐度等因素导致的减产、病害以及生长缓慢等问题。特别是在雨季时,地处江河附近的刺参池塘极易受到降雨影响而导致海水盐度降低,造成刺参大量的发病和死亡,给刺参养殖业造成极大的经济损失。本文通过刺参的溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)、Na+,K+-ATPase基因(Na+,K+-ATPase gene,NKA)及NKCC1基因等的体内RNA干扰试验,研究其在刺参盐度适应性状中的功能,为刺参健康可持续养殖奠定基础。(1)本研究中分别构建了溶菌酶基因的Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2、Rip-LYZ-3,Na+,K+-ATPase基因的Rip-NKA-1、Rip-NKA-2、Rip-NKA-3和NKCC1基因的Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2、Rip-NKCC-3 RNA干扰重组质粒。以培养的刺参体腔液原代细胞为靶细胞检测RNA干扰重组质粒对其靶基因的沉默效率,通过测定其靶基因的相对表达量和酶活性变化来筛选最佳干扰质粒。结果显示:Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2和Rip-LYZ-3的沉默效率为40%、45%、0%,Rip-NKA-1、Rip-NKA-2和Rip-NKA-3的沉默效率为32%、46%、39%,Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2和Rip-NKCC-3的沉默效率为18%、51%、11%;此外,Rip-LYZ-2和Rip-NKA-2均对其靶基因的表达量和酶活性产生了极为显著的(P0.01)抑制作用。上述结果为后续的刺参体内RNA干扰试验提供了重要的参考依据。(2)为了探索刺参体内RNA干扰的方法,本试验以Rip-LYZ-2为干扰质粒进行LYZ基因的体内RNA干扰。分别以口腔注射和体腔注射的方式转染等量的Rip-LYZ-2,48小时后提取刺参体腔液、肌肉和管足组织用于测定各试验组LYZ基因的表达量变化情况。结果显示:口腔注射组中,体腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相对表达量分别为0.58、0.24和1.6;腹腔注射组中,体腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相对表达量分别为1.3、560和0.27。表明从口腔注射RNA干扰重组质粒能够获得更为稳定的RNA干扰效应和更高的沉默效率。接下来以口腔注射的方式分别注射0.5μg、5μg、10μg和25μg的Rip-LYZ-2。48小时后提取刺参体腔液、肌肉和管足组织用于测定各试验组LYZ基因的表达变化情况。结果显示:注射剂量为0.5μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为1.38、2.69和4.92;注射剂量为5μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为2.24、0.78和4.55;注射剂量为10μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为0.08、1.17和0.15;注射剂量为25μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为0.6、0.13和0.04。表明:当RNA干扰重组质粒的注射剂量达到10μg及以上时,对刺参体内靶基因的表达形成了较为稳定的RNA干扰效应。最后,以口腔注射的方式转染Rip-LYZ-2,并分别在转染后0 h、12 h、24 h、48 h、4 d和8 d后提取刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织,对LYZ基因表达量和溶菌酶活性进行测定。结果显示:体腔液和肌肉中LYZ基因表达量在前48 h呈下降趋势,之后其表达量快速上升,体腔液中溶菌酶活性则持续下降,肌肉中溶菌酶活性一开始即上升,而在24 h和48 h未检测到溶菌酶活性,之后溶菌酶活性快速上升;体壁中LYZ基因表达量及其酶活性的变化趋势基本一致,总体上呈先上升后下降再上升的趋势;疣足中LYZ基因表达量及其酶活性在前48 h未出现显著变化,并分别在48 h达到最小值,之后开始回升;管足中LYZ基因的表达量在12 h显著上升(P0.05),之后其表达量快速下降,并于48 h后逐步回升,其酶活性一开始即快速上升,在12 h后酶活性持续下降。表明刺参的RNA干扰效应具有系统性,即局部注射干扰质粒能够在动物个体的不同组织和器官引起靶基因表达的降低,且mi RNA介导的刺参体内RNA干扰效应能够持续四天左右。(3)分别进行低盐胁迫条件下LYZ、NKA和NKCC1基因的体内RNA干扰实验。在转染后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h抽取刺参体腔液用于测定基因的表达变化情况。结果显示:LYZ试验组的LYZ基因表达量在24 h和72 h时显著低于对照组(P0.05),而其酶活性在24 h和48 h时亦显著低于对照组(P0.05),NKA和NKCC1的表达量显著低于对照组(P0.05);NKA试验组的NKA基因表达量在12 h和24 h时显著低于对照组(P0.05),其酶活性在24 h和96 h时显著低于对照组(P0.05),NKCC1的表达量在12 h到72 h间显著低于对照组,LYZ的表达量和酶活性在部分时刻亦低于对照组;NKCC试验组NKCC1和NKA的表达量分别在前48 h和24 h显著低于对照组;此外,通过测定各对照组和试验组刺参体腔液中Na+、K+和Cl-的浓度表明:各试验组刺参体腔液细胞调节渗透压的能力降低。进一步验证了LYZ、NKA和NKCC1基因在刺参盐度适应中的功能,且这三者之间存在复杂的互作机制。
【关键词】：刺参 RNA干扰 溶菌酶 Na~+ K~+-ATPase NKCC1
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 研究背景12
• 1.2 海水盐度对刺参的影响12-14
• 1.2.1 盐度胁迫对刺参生长发育、存活率和行为的影响12-13
• 1.2.2 盐度胁迫对刺参非特异性免疫的影响13-14
• 1.3 盐度对刺参渗透压及呼吸代谢的影响14
• 1.4 刺参盐度相关基因的研究进展14-21
• 1.4.1 溶菌酶的研究14-16
• 1.4.2 Na~+,K~+-ATPase的研究16-19
• 1.4.3 NKCC基因的研究19-21
• 1.5 RNAi的研究进展21-23
• 1.5.1 RNAi的原理21-22
• 1.5.2 RNAi在水产动物研究中的应用22-23
• 1.6 本研究的目的、意义23-24
• 第二章 刺参盐度相关基因RNA干扰重组质粒的构建及筛选24-40
• 2.1 材料与试剂24-25
• 2.1.1 动物材料24
• 2.1.2 质粒和菌种24
• 2.1.3 培养基和溶液配方24-25
• 2.1.4 其他试验试剂及器材25
• 2.2 试验方法25-33
• 2.2.1 RNA干扰重组质粒的构建25-28
• 2.2.2 RNA干扰重组质粒的初筛28-30
• 2.2.3 进一步验证RNA干扰重组质粒对靶基因的干扰效果30-33
• 2.3 结果与分析33-38
• 2.3.1 RNA干扰重组质粒的鉴定与测序33-35
• 2.3.2 溶菌酶基因RNA干扰重组质粒筛选结果35-36
• 2.3.3 Na~+,K~+-ATPae基因RNA干扰重组质粒筛选结果36-37
• 2.3.4 NKCC1基因RNA干扰重组质粒筛选结果37-38
• 2.4 讨论38-40
• 第三章 刺参体内RNA干扰方法的初步研究40-48
• 3.1 材料与试剂40
• 3.1.1 动物材料40
• 3.1.2 质粒和菌种40
• 3.1.3 培养基和溶液配方40
• 3.1.4 实验试剂及器材40
• 3.2 实验方法40-42
• 3.2.1 RNA干扰重组质粒的制备40-41
• 3.2.2 从不同部位注射RNA干扰重组质粒41
• 3.2.3 以不同剂量注射RNA干扰重组质粒41
• 3.2.4 测定转染后不同时间点溶菌酶基因的表达量41-42
• 3.3 结果与分析42-45
• 3.3.1 从不同部位注射Rip-LYZ-2 后溶菌酶基因的表达量变化42-43
• 3.3.2 不同剂量条件下刺参溶菌酶基因的相对表达量43
• 3.3.3 转染后不同时间点刺参溶菌酶基因的表达量变化43-45
• 3.4 讨论45-48
• 第四章 刺参LYZ、NKA和NKCC1基因的体内RNA干扰48-68
• 4.1 材料与试剂48
• 4.1.1 动物材料48
• 4.1.2 质粒和菌种48
• 4.1.3 培养基和溶液配方48
• 4.1.4 试验试剂和器材48
• 4.2 试验方法48-52
• 4.2.1 RNA干扰重组质粒的制备48-49
• 4.2.2 RNA干扰重组质粒转染刺参49
• 4.2.3 检测转染后体腔液中靶基因的表达量变化49-50
• 4.2.4 检测转染后相关酶活性及离子浓度50-52
• 4.3 结果与分析52-64
• 4.3.1 RNA干扰重组质粒的制备52
• 4.3.2 溶菌酶基因体内RNA干扰结果52-56
• 4.3.3 Na~+,K~+-ATPae基因体内RNA干扰结果56-61
• 4.3.4 NKCC1基因体内RNA干扰结果61-64
• 4.4 讨论64-68
• 4.4.1 刺参溶菌酶基因体内RNA干扰结果分析64-65
• 4.4.2 刺参Na~+,K~+-ATPase基因体内RNA干扰结果分析65-66
• 4.4.3 刺参NKCC1基因体内RNA干扰结果分析66-68
• 参考文献68-82
• 攻读学位期间发表的论文目录82-88
• 致谢88

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本文编号：787175