microRNAs对黄牛和水牛朊病毒基因转录后调控研究

发布时间：2017-09-03 23:30

  本文关键词：microRNAs对黄牛和水牛朊病毒基因转录后调控研究

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【摘要】：朊病毒疾病(Prion diseases)是一类由朊病毒(Prion protein,PrP)引起的致死性神经退行性疾病,又称为传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSE)。如牛的疯牛病、羊的瘙痒症,以及人的变异型克雅氏症等。目前普遍认可的致病原因是由于细胞表达的正常型朊蛋白(PrPC),在外界诱因作用下构象发生改变,形成异常的致病型朊病毒(PrPsc)。其中致病型朊病毒会不断诱导正常型朊病毒转变成致病型病毒,进而使致病型病毒在中枢神经系统中迅速积累,最终使疾病爆发。目前,全球已有近20万头的黄牛被报道感染疯牛病,但是至今没有水牛感染疯牛病的报道。我们以往的研究结果显示,遗传因素在水牛和黄牛对疾病的易感性上有着不可忽视的作用。我们分析了于疾病传染性相关的几个重要组织中朊病毒基因(PRNP)和朊病毒蛋白(PrP)的表达情况,结果显示：在几类组织中,黄牛的PrP表达显著高于水牛。但有趣的是,PRNP mRNA转录和PrP翻译不是同步的,提示在黄牛和水牛中PRNP基因可能受到了复杂的转录后调控作用。因此,深入研究PRNP基因的转录后调控机制有助于我们进一步认识朊病毒疾病的致病机理。microRNA(miRNA)是转录后调控蛋白质表达的重要方式。miRNA在细胞中参与了许多重要生物过程,如发育、增殖、分化、凋亡等,与生物体的发育和疾病密切相关。研究发现miRNA的异常表达与朊病毒疾病的易感性、发生和发展密切相关。本研究中,我们从miRNA对靶基因的调控入手,解析了miRNA调控黄牛和水牛PRNP基因转录后差异表达的分子机制。首先,通过3'RACE和测序技术,我们注释了水牛PRNP基因的3'UTR；然后,分析了黄牛和水牛PRNP基因3'UTR的种间固定差异,通过对12头黄牛和14头水牛的PRNP基因3'UTR进行全长测序,共检测到144个种间固定差异位点,包括水牛中UTR-1区(包含g.67352-67379del→28-bp插入和g.67387-g.67388TG→CC)和UTR-2区(含有一个AG插入位点,即g.67468de1→A,g.67469del→G)多态；接下来,扩大样本量重测序了这两个区域,其中UTR-1区用了162个水牛样品,194个黄牛样品重测序,而UTR-2区用了174个水牛样品,192个黄牛样品重测序；结果发现水牛中UTR-1区中28-bp插入及两个碱基替换频率为80.2%,而UTR-2区中AG插入频率为96.0%,但是黄牛均无以上现象；我们用软件预测到有17个miRNAs可能作用于这两个区域。进一步的荧光双报告实验证实其中有5个miRNAs具有调控作用,它们是作用于UTR-1的miR-145-5P、miR-328-3P、miR-338-3P和作用于UTR-2的是miR-125b-5P和miR-331-3P:最后,我们采用qPCR的方法检测了这5个miRNAs在黄牛和水牛脑闩中的表达情况,发现这5个miRNAs在黄牛和水牛脑闩中均有表达；与其它miRNA相比,miR-125b-5p的表达量在黄牛和水牛中都是最高的；有意思的是,miR-331-3P在水牛脑闩中的含量要显著高于黄牛。我们推测miR-331-3P调控水牛PRNP基因转录后的表达,可能是导致水牛的朊病毒蛋白表达低于黄牛的原因,揭示了黄牛和水牛PNRP基因不同的转录后调控机制。本研究从新的视角探讨水牛和黄牛朊病毒疾病易感性差异的原因。研究结果将为解析悬而未决的朊病毒疾病致病机理的提供有意义的线索,为朊病毒疾病的治疗提供新思路。
【关键词】：朊病毒疾病 miRNA 转录后调控 PRNP 3'UTR
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一部分 背景9-20
• 一、朊病毒疾病的种类9-11
• 1 疯牛病9-10
• 2 羊瘙痒病10
• 3 猫科动物海绵状脑病10-11
• 4 变异型克雅氏病11
• 二、朊蛋白基因的研究进展11-15
• 1 PRNP基因的功能及其与朊病毒疾病的关系11-14
• 2 黄牛和水牛PRNP基因转录前后表达差异的研究14-15
• 三、MicroRNA与朊病毒疾病15-19
• 1 MicroRNA的产生15-17
• 2 miRNA的特点17
• 3 miRNA与朊病毒疾病的关系17-19
• 四、本研究目的19-20
• 第二部分 实验材料和方法20-43
• 1 实验材料20-23
• 1.1 实验样品20-21
• 1.2 主要仪器21-22
• 1.3 主要试剂22-23
• 1.4 主要试剂盒23
• 2 实验方法23-43
• 2.1 用于3'RACE的cDNA的制备23-25
• 2.2 用于miRNA表达量分析的cDNA的制备25-26
• 2.3 3'RACE技术确认水牛PRNP基因3'UTR26-27
• 2.4 产物的回收27-28
• 2.5 测序28-30
• 2.6 DNA提取30-31
• 2.7 聚合酶链式反应(PCR)扩增黄牛和水牛PRNP基因3'UTR31-33
• 2.8 聚合酶链式反应(PCR)扩增PRNP3'UTR区固定差异位点33-35
• 2.8.1 PCR扩增和测序黄牛和水牛UTR-1区33-34
• 2.8.2 PCR扩增和测序黄牛和水牛UTR-2区34-35
• 2.9 克隆35-36
• 2.10 质粒提取36
• 2.11 miRNA的识别预测36
• 2.12 荧光双报告载体构建36-40
• 2.13 细胞转染及荧光双报告检测40
• 2.14 荧光定量PCR扩增40-42
• 2.15 miRNA相对表达量的计算42-43
• 第三部分 实验结果43-54
• 1 水牛PRNP基因3'UTR的注释43-45
• 2 黄牛和水牛PRNP基因3'UTR的扩增和测序结果45-49
• 2.1 PCR扩增和测序结果45-48
• 2.2 检测UTR-1区在黄牛和水牛群体中的分布情况48-49
• 2.3 PCR扩增和测序黄牛和水牛UTR-2区的统计49
• 3 miRNA的识别预测结果49-50
• 4 miRNA与PRNP基因的靶标关系验证结果50-52
• 5 miRNA表达分析52-54
• 第四部分 总结与讨论54-57
• 参考文献57-65
• 致谢65-67
• 在学期间获奖和发表论文情况67

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本文编号：788021