黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重组与表达
发布时间：2017-09-05 17:14
本文关键词：黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重组与表达
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【摘要】：葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,简称GOD)能催化β-D-葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和过氧化氢,具有去葡萄糖、除氧、抑菌、产葡萄糖酸等功效,广泛应用于食品、饲料、医药、纺织等各大领域。目前,工业上主要通过黑曲霉、青霉属菌株来生产葡萄糖氧化酶。它们产生的GOD主要分布于胞内、胞壁之中,纯化过程损失大,产率较低。丝状真菌里氏木霉具有蛋白表达量大、胞外分泌率高等优良特性,利用基因工程技术在里氏木霉中表达葡萄糖氧化酶是实现该酶高效率生产的有效途径。本文依据里氏木霉密码子偏好性对黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行密码子优化。将合成的GOD编码序列嵌入里氏木霉强启动子(含信号肽)Pcbhl-ss、终止子Tcbhl之间构成完整的表达盒,并与潮霉素B抗性标记一同构成最终表达载体pCB-GODo该质粒载体经农杆菌介导转化至里氏木霉细胞中进行表达,共得到45株阳性转化子。通过双层平板筛选法对里氏木霉转化子进行初筛,确定蓝色圈直径最大的4株转化子进行摇瓶复筛,获得性能优良的重组里氏木霉T.reesei ZU-G3。该菌株72h发酵液中的GOD酶活高达100.20U/mL。用SDS-PAGE检测重组里氏木霉发酵液可得到约80kDa的葡萄糖氧化酶条带。将转化子重复传代培养10个批次后,提取染色体DNA进行PCR验证,可检测到约1.7kb的葡萄糖氧化酶基因条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。从蛋白质及分子层面进一步验证了葡萄糖氧化酶已成功实现异源表达与胞外分泌。通过单因素实验对里氏木霉发酵培养基成分及发酵条件逐一进行了优化。最终得到优化后的里氏木霉发酵培养基(1L)：乳糖20g,微晶纤维素20g,蛋白胨9g, (NH4)2SO4 2.8g, KH2PO4 4g, MgSO4-7H2O 0.6g, CaCl2 0.6g,微量元素2mL。优化后的最适发酵条件为28℃、pH 5.5。采用优化后的发酵培养基,在最适发酵条件下摇瓶产酶72h,葡萄糖氧化酶活力最高,达到154.87U/mL,约是优化前GOD活力的1.5倍。研究了重组里氏木霉ZU-G3发酵所得葡萄糖氧化酶的酶学性质,发现葡萄糖氧化酶的最适反应温度、pH分别为40℃、pH5.5。当温度在20～45℃的范围内时,酶的稳定性较为理想,水浴保温1h后仍保留超过85%的酶活力。将酶置于微酸性环境(pH 5.0～6.5)中保存24h,其酶活仍保留愈80%,稳定性较好。金属离子对酶活性的影响各不相同,Ca3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+离子能不同程度地促进葡萄糖氧化酶的活性,Pb2+、Ag+、Fe2+离子则抑制作用明显。而K+、Na+、 Mg2+离子对GOD酶活基本没有影响。本课题实现了黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的重组与表达。相关研究成果对丝状真菌基因重组表达体系的构建具有重要意义,为葡萄糖氧化酶的规模化生产及工业化应用奠定了坚实的基础。
【关键词】：葡萄糖氧化酶 里氏木霉 基因重组 分泌表达 发酵优化 酶学性质
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：
- 致谢5-6
- 摘要6-8
- Abstract8-13
- 1 绪论13-24
- 1.1 葡萄糖氧化酶简介13
- 1.2 葡萄糖氧化酶的来源13-14
- 1.3 葡萄糖氧化酶的反应机制14
- 1.4 葡萄糖氧化酶的分子结构14-15
- 1.5 葡萄糖氧化酶的酶学性质15
- 1.6 葡萄糖氧化酶的酶活测定方法15-16
- 1.7 葡萄糖氧化酶的应用16-21
- 1.7.1 食品饮料添加剂16-19
- 1.7.2 医药行业19
- 1.7.3 生物技术领域19-21
- 1.7.4 其他应用21
- 1.8 葡萄糖氧化酶的分子生物学进展21-23
- 1.9 本课题研究内容23-24
- 2 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的表达24-43
- 2.1 引言24
- 2.2 材料与方法24-35
- 2.2.1 材料与试剂24-25
- 2.2.2 培养基25-26
- 2.2.3 实验仪器26-27
- 2.2.4 实验方法27-35
- 2.3 结果与讨论35-41
- 2.3.1 葡萄糖氧化酶基因的密码子优化35-36
- 2.3.2 重组载体的构建36-38
- 2.3.3 里氏木霉转化子的筛选38-39
- 2.3.4 里氏木霉转化子的传代稳定性39-40
- 2.3.5 发酵上清液蛋白电泳检测40-41
- 2.4 本章小结41-43
- 3 重组里氏木霉ZU-G3发酵产葡萄糖氧化酶条件的优化43-53
- 3.1 引言43
- 3.2 材料与方法43-46
- 3.2.1 材料与试剂43-44
- 3.2.2 培养基44
- 3.2.3 实验仪器44
- 3.2.4 实验方法44-46
- 3.3 结果与讨论46-52
- 3.3.1 碳源对重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的影响46-47
- 3.3.2 氮源对重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的影响47-48
- 3.3.3 牛肉膏浓度对重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的影响48-49
- 3.3.4 发酵温度对重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的影响49-50
- 3.3.5 发酵初始pH对重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的影响50-51
- 3.3.6 重组T.reesei ZU-G3产葡萄糖氧化酶的时间进程51-52
- 3.4 本章小结52-53
- 4 重组里氏木霉ZU-G3葡萄糖氧化酶的酶学性质研究53-63
- 4.1 引言53
- 4.2 材料与方法53-57
- 4.2.1 材料与试剂53
- 4.2.2 实验仪器53-54
- 4.2.3 实验方法54-57
- 4.3 结果与讨论57-62
- 4.3.1 葡萄糖氧化酶酶促反应的最适温度57
- 4.3.2 葡萄糖氧化酶的温度稳定性57-58
- 4.3.3 葡萄糖氧化酶酶促反应的最适pH58-59
- 4.3.4 葡萄糖氧化酶的pH稳定性59-60
- 4.3.5 金属离子对葡萄糖氧化酶活性的影响60-61
- 4.3.6 葡萄糖氧化酶酶液的贮存稳定性61-62
- 4.4 本章小结62-63
- 5 结论与展望63-66
- 5.1 结论63-64
- 5.1.1 黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在里氏木霉中的表达63
- 5.1.2 重组里氏木霉T.reesei ZU-G3发酵产葡萄糖氧化酶条件的优化63-64
- 5.1.3 重组里氏木霉T.reesei ZU-G3葡萄糖氧化酶的酶学性质研究64
- 5.2 展望64-66
- 参考文献66-74
- 附录：论文发表情况74
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本文编号：799233
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