基于全基因组关联性分析的酒酒球菌抗酸基因研究

发布时间：2017-09-05 16:29

  本文关键词：基于全基因组关联性分析的酒酒球菌抗酸基因研究

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【摘要】：苹果酸-乳酸发酵(Malolactic acid fermentation,MLF)是继酒精发酵结束后的第二次发酵过程。经过MLF可以将尖酸的苹果酸转化成口感柔和的乳酸,在降低葡萄酒总酸的同时,改善葡萄酒的色泽、风味,提高葡萄酒微生物稳定性。目前,生产中主要使用的启动并主导完成苹果酸-乳酸发酵的微生物是酒酒球菌。但是,酒精发酵结束后的酒体环境营养物质匮乏、乙醇含量高、pH低等恶劣条件使得MLF启动困难。其中高酸环境是由果实原料中苹果酸、酒石酸的含量过高造成的。生产上往往通过添加碳酸钙或碳酸氢钾的方法达到降酸的目的,但是这种化学降酸的方式直接降低葡萄酒对病害的抗性,导致葡萄酒质量下降。因此,增强酒酒球菌自身抗酸胁迫能力势在必行。对酒酒球菌抗酸基因的相关研究可以帮助科研者深入了解菌株抗逆性机制,更好地筛选耐酸胁迫菌株,酿造出高品质葡萄酒。本文首先采用离子注入诱变对3株筛选自陕西的酒酒球菌进行人工诱变,然后将经过离子注入的菌株,直接转接至胁迫环境下(ATB pH 3.0/pH 9.0)培养筛选。对获得的突变酒酒球菌在pH 3.0环境(ATB培养基)下的生长力、β-葡萄糖苷酶活性及L-苹果酸消耗量进行比较分析。最终筛选6株表型差异较大的突变酒酒球菌送样进行重测序,并利用全基因组关联性分析的方式对重测序数据进行统计,对可能参与酒酒球菌酸胁迫调控机制的基因进行初步的研究。主要研究结果如下:(1)从实验室保存的40株酒酒球菌中进行初步筛选,最终确定SX-1a、SX-1b、CS-1b为出发菌株,进行离子注入诱变。将经过离子注入诱变的菌株,直接转入胁迫环境(ATB pH 3.0/pH 9.0)培养,经过继代培养、纯化、再次继代培养步骤后,共获得突变菌株10株,其中筛选自pH 3.0酸胁迫环境包括:SX-1a突变菌1株,SX-1b突变株2株,CS-1b突变株2株;筛选自pH 9.0碱胁迫条件的突变菌株包括:SX-1a 2株,SX-1b1株,CS-1b 2株。且每次每株菌继代培养代数均在12代以上(N≥12),以确保获得的突变株具有稳定的耐酸/酸敏性状。经验证出发菌株SX-1a、SX-1b、CS-1b在pH 3.0以及pH 9.0胁迫环境中,在连续培养3-5代后,菌株基本已经丧失活性。(2)对所有菌株在胁迫条件(pH 3.0)下的生长活性(即OD600的数值)进行测定,并绘制生长曲线。试验数据显示所有耐酸突变菌(即筛选自pH 3.0 ATB胁迫环境)的生长活性均远高于出发菌株;而所有的酸敏突变菌(即筛选自pH 9.0 ATB胁迫环境)的生长活性均低于出发菌株。(3)突变菌株的β-葡萄糖苷酶活性检测的试验数据显示,耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶活性远高于出发菌株,而酸敏突变株的β-葡萄糖苷酶活性却低于出发菌株。(4)L-苹果酸降解试验显示,所有突变酒酒球菌均保持正常MLF能力。且耐酸突变酒酒球菌的L-苹果酸降解能力强于酸敏突变酒酒球菌。(5)GWAS统计数据显示,共3916个SNP与耐酸差异表型性状显著相关,这3916个SNP分别位于181个基因内。且对181个基因的GO注释和KEGG注释结果显示,基因分布最多的分类在微生物中都起着最基本或最主要的功能。
【关键词】：酒酒球菌 酸胁迫调控基因 GWAS
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS261.1
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 简介11
• 1.2 葡萄酒中的乳酸菌11-12
• 1.3 酒球菌属多样性12
• 1.4 抗酸机制研究进展12-15
• 1.4.1 革兰氏阳性细菌抗酸机制研究进展12-13
• 1.4.2 酒酒球菌酸胁迫机制研究进展13-15
• 1.5 酒酒球菌抗酸/酸敏菌株RAPD标记15
• 1.6 全基因组关联分析研究进展15-16
• 1.7 离子注入诱变育种16
• 1.8 研究目的及意义16-17
• 1.9 研究内容及技术路线17-19
• 1.9.1 研究内容17-18
• 1.9.2 技术路线18-19
• 第二章 抗酸差异表型菌株的筛选19-25
• 2.1 试验材料19-20
• 2.1.1 试验菌株19
• 2.1.2 试验仪器与设备19
• 2.1.3 培养基配置19-20
• 2.2 试验方法20-21
• 2.2.1 菌株初步筛选20
• 2.2.2 离子注入诱变育种20-21
• 2.3 试验结果及分析21-25
• 2.3.1 菌株初筛21-24
• 2.3.3 小结24-25
• 第三章 突变酒酒球菌表型差异比较分析25-31
• 3.1 试验材料25-26
• 3.1.1 试验仪器与试剂25
• 3.1.2 试验菌株与培养基配置25-26
• 3.2 试验方法26-27
• 3.2.1 样品的制备26
• 3.2.2 β-葡萄糖苷酶活性测定方法26
• 3.2.3 对硝基苯酚标准曲线26
• 3.2.4 苹果酸降解试验26-27
• 3.3 统计分析27
• 3.4 试验结果与分析27-31
• 3.4.1 pH 3.0 下菌株的生长曲线27-28
• 3.4.2 β-葡萄糖苷酶活性测定28-29
• 3.4.3 苹果酸降解试验29-30
• 3.4.4 小结30-31
• 第四章 全基因组关联性分析31-46
• 4.1 试验材料31
• 4.1.1 试验菌株31
• 4.1.2 主要试剂31
• 4.1.3 主要仪器和设备31
• 4.2 试验方法31-32
• 4.2.1 菌株活化31
• 4.2.2 DNA提取31
• 4.2.3 DNA检测31
• 4.2.4 测序及生物信息分析31-32
• 4.3 结果与分析32-46
• 4.3.1 送样菌株DNA提取浓度、纯度分析32-33
• 4.3.2 测序数据质量统计33-34
• 4.3.3 编码基因预测34
• 4.3.4 重复序列统计分析34-38
• 4.3.5 NR数据库注释38-39
• 4.3.6 共有和特有基因分析39-40
• 4.3.7 SNP统计与注释40-42
• 4.3.8 GWAS统计分析42
• 4.3.9 统计基因的GO分类和KEGG功能富集42-44
• 4.3.10 小结44-46
• 第五章 结论与展望46-48
• 5.1 结论46
• 5.2 主要创新点46
• 5.3 展望46-48
• 参考文献48-53
• 附录153-62
• 致谢62-63
• 作者简介63

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本文编号：799056