脊尾白虾蜕皮和性别调控相关基因的鉴定及功能分析

发布时间：2017-09-07 05:20

  本文关键词：脊尾白虾蜕皮和性别调控相关基因的鉴定及功能分析

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【摘要】：脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是我国重要的经济甲壳动物,了解其内分泌调控及性别调控机制在理论和实践上具有重要的指导意义。甲壳动物内分泌调控是由多种激素协同作用,共同调控其蜕皮、生长、发育等生理过程。甲壳动物的蜕皮和生长是密切相关的,甲壳动物只有通过不断蜕皮才能完成其生长和发育过程。对甲壳动物性别分化和性别决定机制的研究是实现甲壳动物性别控制的基础,一直是国际同行所关注的热点问题。本论文利用脊尾白虾为研究对象,鉴定了与蜕皮或性别发育相关的几个重要功能基因,并对其功能进行了初步分析,以期为阐明甲壳动物的蜕皮调控和性别发育机制提供重要基础。主要进展简述如下：甲壳动物的蜕皮是与其生长、变态和繁殖密切相关的重要生理过程。前期的研究表明蜕皮过程是由20-羟基蜕皮酮(20E)及其上游的激素、多肽和环境因子共同调控的,然而对于20E调控的下游基因以及其在蜕皮中的功能仍不清楚。蜕壳激素基因(eclosion hormone, EH),又称为羽化激素,最早是从飞蛾中分离得到的,随后在其他昆虫如烟草天蛾(Manduca sexta)、家蚕(Bombyx mori)、果蝇(Drosophila melanogaster)中都有报道。EH是由昆虫的腹神经细胞合成和分泌的一类神经肽,在昆虫蜕皮中起着重要的作用,至于EH在甲壳动物蜕皮中的作用了解得很少。本论文从脊尾白虾中获得了与昆虫的EH编码基因具有一定相似性的序列(命名为EcEH),其开放阅读框(ORF)为273bp,可编码90个氨基酸；氨基酸序列包括一段疏水的信号肽,6个保守的半胱氨酸残基,具有保守的eclosion结构域。组织表达分析结果表明,EcEH转录本主要在鳃、表皮及眼柄中表达。EcEH在脊尾白虾不同的蜕皮时期,其转录表达发生明显的变化,在蜕皮前期(late premolt)表达量最高,而在其它蜕皮时期,其表达量维持在较低水平,提示其可能与蜕皮相关。利用RNAi干扰技术和外源20-羟基蜕皮酮(20E)激素注射的方法进一步研究了EH在脊尾白虾蜕皮中的功能, 结果表明注射EcEH的双链RNA会导致蜕皮过程明显延迟,注射外源的20E可以明显加快蜕皮进程。以上研究结果说明EcEH与脊尾白虾的蜕皮密切相关。胰岛素样促雄性腺激素(Insulin-like androgenic gland hormone, IAG)由甲壳动物雄性个体所独有的促雄性腺(Angrogenic gland, AG)分泌,在雄性甲壳动物的性别分化、雄性性征维持和精子发生中发挥着关键作用。IAG基因在沼虾、对虾、蟹类中均有报道, 但是对其功能的研究相对较少。本论文从脊尾白虾中克隆了IAG基因(EcIAG),并对其功能进行了分析。EcIAG基因的ORF全长531bp,可编码176个氨基酸；包括一段疏水的信号肽,6个保守的半胱氨酸残基,具有保守结构域(insulin-like IPRO16179)。EcIA G主要在雄性个体的促雄性腺(AG)及精巢(Te)中表达。原位杂交分析表明：EcIAG的转录本主要定位在促雄性腺细胞。对不同胚胎和幼体发育时期的转录表达分析结果表明,EcIAG在原肠期和仔虾P2期有着较高表达。为了解眼柄内分泌中心是否对EcIAG的表达具有调控作用,我们研究眼柄摘除对其表达的影响。结果表明：眼柄摘除后EcIAG的转录表达明显提高,说明眼柄中存在调控IAG表达的激素。原位杂交的相关研究为理解甲壳动物的性别分化调控通路提供了一定基础。Sox9(SRY-box9)基因是一类与动物性别决定基因SRY具有高度序列相似性的转录因子。基于Sox9在哺乳动物等物种中参与性别调控过程,本研究尝试探讨EcSox9在促雄性腺中的表达分布情况及其与EcIAG之间的调控关系。本研究从脊尾白虾中克隆获得Sox9基因,其ORF全长672bp,编码243个氨基酸；推导的氨基酸序列具有保守的HMG BOX结构域。EcSox9转录本在各组织中广泛存在,但在鳃及肝胰腺中表达量最高。EcSox9的表达随着胚胎和幼体发育时期的推移而呈现表达增加的趋势。EcSox9在摘除眼柄的脊尾白虾促雄性腺中表达量增加,表明眼柄中可能存在内分泌调控因子对EcSox9基因的表达具有调控作用。利用RNAi技术研究了EcSox9和EcIAG基因之间的关系,结果表明：注射EcSox9的双链RNA(dsSox9)时,EcIAG的表达量显著降低,表明EcSox9可能对EcIAG的表达存在正调控的关系；而在注射EcIAG的双链dsIAG时,EcSox9的表达量却显著升高,表明EcIAG的表达水平对EcSox9的表达存在反馈调控作用。相关研究结果为阐明Sox9在甲壳动物性别决定中的作用提供了重要资料。
【关键词】：脊尾白虾 EH基因 IAG基因 Sox9基因 蜕皮 性别决定
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q953
【目录】：

• 致谢4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 绪论15-33
• 1.1 甲壳动物内分泌调控系统的研究进展和现状15-20
• 1.1.1 甲壳动物内分泌调控相关的内分泌器官15-16
• 1.1.2 甲壳动物内分泌调控的相关激素16-18
• 1.1.3 甲壳动物内分泌调控途径的相关假说18-20
• 1.1.4 甲壳动物内分泌调控的环境影响因子20
• 1.2 蜕皮过程的研究进展20-27
• 1.2.1 蜕皮及蜕皮周期的分类20-22
• 1.2.2 蜕皮过程及内分泌调控关系22-24
• 1.2.3 昆虫的蜕皮调控机制与甲壳类的蜕皮机制24-26
• 1.2.4 昆虫与甲壳动物的内分泌学(蜕皮与生长繁殖)比较26-27
• 1.3 甲壳动物性别决定及性别分化研究进展27-29
• 1.3.1 性别决定机制与性别分化的相关基因27-28
• 1.3.2 虾类性别决定及性别分化的研究进展28-29
• 1.4 甲壳动物内分泌调控及性别决定与性别分化的关系29-30
• 1.5 本研究的目标及意义30-31
• 1.6 本研究的主要内容和技术路线31-33
• 第二章 脊尾白虾EH基因的鉴定及功能分析33-57
• 2.1 材料和方法33-47
• 2.1.1 实验动物33
• 2.1.2 组织取样33
• 2.1.3 实验试剂33-34
• 2.1.4 实验仪器34-35
• 2.1.5 总RNA的提取及cDNA的合成35-36
• 2.1.6 基因的克隆及序列分析36-38
• 2.1.7 荧光实时定量PCR(quantitative PCR,qPCR)38-39
• 2.1.8 原位杂交39-44
• 2.1.9 dsEH的合成44-45
• 2.1.10 dsRNA与20E剂量的最优化45-46
• 2.1.11 dsRNA与20E对蜕皮过程的影响46
• 2.1.12 dsRNA与20E对蜕皮率的影响46-47
• 2.2 结果与分析47-54
• 2.2.1 脊尾白虾EH基因的鉴定、结构分析及亲缘关系分析47-49
• 2.2.2 脊尾白虾EH基因在不同组织的表达特征分析49-50
• 2.2.3 脊尾白虾EH基因在不同蜕皮阶段的表达特征分析50-51
• 2.2.4 脊尾白虾dsEH干扰或20E激素注射对EH基因的表达特征分析51-52
• 2.2.5 脊尾白虾dsEH干扰或20E激素注射对蜕皮过程的影响52-53
• 2.2.6 脊尾白虾dsEH干扰或20E激素注射对蜕皮率的影响53-54
• 2.3 讨论54-57
• 第三章 脊尾白虾IAG基因的鉴定及功能分析57-73
• 3.1 材料与方法57-63
• 3.1.1 实验动物57
• 3.1.2 组织取样57
• 3.1.3 实验试剂57
• 3.1.4 实验仪器57-58
• 3.1.5 总RNA的提取及cDNA的合成58
• 3.1.6 基因克隆及序列分析58-59
• 3.1.7 定量PCR(qPCR检测)59-60
• 3.1.8 原位杂交60-61
• 3.1.9 dsIAG的合成61-62
• 3.1.10 dsRNA干扰剂量最优化62
• 3.1.11 眼柄切除之后,AG的形态学观察,组织定位及IAG表达变化62-63
• 3.2 结果与分析63-70
• 3.2.1 脊尾白虾IAG基因的鉴定、结构分析及亲缘关系分析63-66
• 3.2.2 脊尾白虾IAG基因在不同组织的表达特征分析66-67
• 3.2.3 脊尾白虾IAG基因在早期不同发育时期中的表达特征分析67-68
• 3.2.4 脊尾白虾的眼柄摘除,AG的形态学观察、组织定位及表达特征68-70
• 3.3 讨论70-73
• 第四章 脊尾白虾Sox9基因的鉴定及功能分析73-87
• 4.1 材料与方法73-78
• 4.1.1 实验动物73
• 4.1.2 组织取样73
• 4.1.3 实验试剂73
• 4.1.4 实验仪器73
• 4.1.5 总RNA的提取及cDNA的合成73-74
• 4.1.6 基因克隆及序列分析74-76
• 4.1.7 定量PCR(RT-qPCR检测)76-77
• 4.1.8 dsSox9的合成77
• 4.1.9 dsSox9干扰剂量的最优化77-78
• 4.2 结果与分析78-85
• 4.2.1 脊尾白虾Sox9基因的鉴定、结构分析及亲缘关系分析78-81
• 4.2.2 脊尾白虾Sox9基因在不同组织的表达特征分析81-82
• 4.2.3 脊尾白虾Sox9基因在早期不同发育时期中的表达特征分析82-83
• 4.2.4 脊尾白虾Sox9基因在雄性脊尾白虾促雄性腺的表达特征分析83-84
• 4.2.5 脊尾白虾dsSox9及dsIAG梯度剂量最优化及相互调控关系84-85
• 4.3 讨论85-87
• 结论87-89
• 参考文献89-105
• 个人简历105-107
• 硕士期间发表论文与研究成果107

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