家蚕BmJun与BmNep1基因的功能研究

发布时间：2017-09-08 10:47

  本文关键词：家蚕BmJun与BmNep1基因的功能研究

  更多相关文章： 家蚕 JNK信号途径 核仁关键蛋白1基因 基因功能 生殖发育 核糖体生物发生

【摘要】：c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号途径在细胞增殖、转化、分化和凋亡等发育过程中起着重要作用。核仁关键蛋白1(Nep1)基因是酵母核糖体40S小亚基生物发生所必需,人类Nep1基因的突变会引发神经退行性疾病。家蚕是重要的经济昆虫也是鳞翅目的核心模式昆虫,家蚕中Jun和Nep1基因的报道几乎空白。本研究室前期克隆了家蚕BmJun、BmFos和BmNep1基因,但其生物学功能仍有许多不明之处。本文运用RT-PCR、qRT-PCR、IP、Western blotting、免疫组织化学和LC-MS/MS等技术手段,研究了家蚕JNK途径中BmJun蛋白与BmFos蛋白的关系及其对家蚕生殖发育的调控功能;研究了BmNep1蛋白在家蚕幼虫蜕皮与化蛹变态过程中受蜕皮激素诱导在细胞核内的表达调控,探讨了其参与核糖体生物发生的过程及其组织共通性。主要结果如下:1家蚕JNK途径通过调控BmVg的合成和贮存影响生殖发育c-Jun蛋白在哺乳动物中既可以形成同源二聚体,也可与Fos蛋白形成异源二聚体AP-1,发挥转录因子的调控作用。果蝇的DJun和DFos蛋白只形成异源二聚体。本文根据前期克隆的BmJun与BmFos基因序列,构建了pCMV-BmJun-EGFP和pCMV-BmFos-FLAG重组质粒,异源表达于HEK293T细胞系中,提取总蛋白进行了IP实验,结果表明,BmJun与BmFos蛋白存在相互作用,推测其形成BmAP-1发挥调控作用。本实验室前期干涉BmJun出现了子代卵发育不良的结果。基于家蚕卵黄蛋白原(BmVg)在幼虫化蛹变态期间的脂肪体中合成的生理基础,本文调查了该时期BmJun,BmFos与BmVg基因的表达模式。在脂肪体组织中,BmVg基因的表达模式与BmJun/BmFos基因一致,在预蛹期显著上调表达,进一步调查证实BmJun蛋白水平在预蛹期脂肪体中显著升高。BmJun基因及蛋白在卵巢中的表达变化趋势与脂肪体中变化一致。摇摆期干涉BmJun基因,BmVg基因的表达量显著下调。在摇摆期用JNK激酶的抑制剂SP600125处理家蚕,处理组雌性家蚕的BmVg蛋白在脂肪体和卵巢组织中表达量降低,蛹期的卵巢生殖腺系数显著降低,产出发育不良卵及异常产卵的成虫的比例增加,并存在剂量效应。表明BmJun/BmFos可能以二聚体BmAP-1参与调控家蚕BmVg基因在脂肪体组织中的合成,并最终参与卵巢与蚕卵的发育调控。2家蚕BmNep1蛋白受蜕皮激素调控参与核糖体的生物发生Nep1蛋白参与酵母40S核糖体的生物发生,鼠同系物Nep1可恢复酵母Nep1突变引发的功能缺陷,人类Nep1突变引发BCS疾病。昆虫中尚无Nep1与核糖体生物发生相关的功能研究报道。我们前期已在丝腺退化过程中发现BmNep1基因与蜕皮激素初级响应基因BmE74A的上调表达趋势一致,并用20E诱导BmN细胞系中BmNep1的表达。本文调查了BmNep1基因与蛋白在家蚕5龄第3天各组织中的表达谱,发现其在丝腺组织中特异性高表达,进一步调查4龄幼虫蜕皮期间与幼虫化蛹变态期间丝腺中BmNep1蛋白的表达,其随蜕皮激素的滴度增加而上调。在BmNep1被上调表达的5L3至预蛹期期间,免疫沉淀与BmNep1相互作用的蛋白,LC-MS/MS结果表明,几乎所有鉴定的蛋白与核糖体生物发生相关。进一步在卵巢组织中调查结果显示,BmNep1基因与蛋白均受蜕皮激素诱导表达。表明蜕皮激素对BmNep1蛋白的调控是非组织特异性的,BmNep1蛋白可能参与核糖体的生物发生。
【关键词】：家蚕 JNK信号途径 核仁关键蛋白1基因 基因功能 生殖发育 核糖体生物发生
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 序言12-30
• 1 JNK信号途径及其在家蚕中的相关研究12-22
• 1.1 JNK信号途径14-17
• 1.2 JNK信号通路主要成员Jun-Fos/AP-117-19
• 1.3 家蚕Jun-Fos/AP-1 的研究基础与意义19-22
• 2 核糖体必需蛋白 122-28
• 2.1 核糖体的生物发生与核糖体必需蛋白22-24
• 2.2 核糖体必需蛋白1基因的功能及其研究进展24-25
• 2.3 家蚕丝腺细胞核糖体发生与丝蛋白质高效合成25-26
• 2.4 家蚕Nep1的研究基础26-28
• 3 研究目的与意义28
• 4 研究思路28-30
• 第二章 家蚕中JNK途径通过调控VG合成影响生殖30-55
• 1 引言30
• 2 实验材料与方法30-42
• 2.1 实验动物30-31
• 2.2 实验用细胞31-32
• 2.3 常用溶液32-33
• 2.4 常用实验方法33-42
• 3 实验结果42-53
• 3.1 BmJun蛋白在家蚕丝腺中的组织定位42-44
• 3.2 家蚕BmJun蛋白与BmFos蛋白相互作用44-46
• 3.3 家蚕脂肪体中BmJun与BmFos在幼虫化蛹的变态期间的表达模式46-47
• 3.4 干扰BmJun基因后，BmVg基因在家蚕脂肪体中的表达变化47-48
• 3.5 家蚕卵巢中BmJun基因及其蛋白在幼虫化蛹变态过程中同步上调表达48-49
• 3.6 抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）对于子代卵发育的影响49-52
• 3.7 抑制JNK对家蚕卵黄蛋白原蛋白在脂肪体与卵巢中表达的影响52-53
• 4 讨论53-55
• 第三章 家蚕中BmNep1基因的研究55-68
• 1 引言55-56
• 2 材料与方法56-58
• 2.1 实验动物与细胞56
• 2.2 实时定量PCR（qRT-PCR）56
• 2.3 多克隆抗体的制备56
• 2.4 免疫组织荧光56
• 2.5 蛋白银染方法56-57
• 2.6 IP与Western blotting57
• 2.7 LC-MS/MS57-58
• 3 结果与分析58-66
• 3.1 家蚕BmNep1的组织表达58-60
• 3.2 BmNep1蛋白在家蚕蜕皮与变态过程中丝腺中的表达变化60-61
• 3.3 家蚕中BmNep1与核核糖体生物发生相关61-65
• 3.4 BmNep1基因及蛋白在幼虫化蛹变态期间卵巢中的表达变化65-66
• 4 讨论66-68
• 第四章 综合结论和创新点68-71
• 1 综合结论68-70
• 1.1 家蚕JNK途径中主要转录因子BmJun与BmFos蛋白存在相互作用68
• 1.2 家蚕JNK途径中，，BmJun-BmFos/AP-1 通过调控BmVg蛋白的合成调控生殖发育68-69
• 1.3 家蚕中BmNep1蛋白受内源性蜕皮激素调控参与核糖体的生物发生69-70
• 2 主要创新点70-71
• 参考文献71-82
• 研究生期间参与项目及成果82-84
• 附录84-88
• 附录1 文中主要所用缩略词一览表84-86
• 附录2 本文使用的主要生化试剂86-87
• 附录3 本文使用的主要仪器设备87-88
• 致谢88-89

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