鸡MTNR1A基因启动子克隆及活性分析

发布时间：2017-09-09 05:12

  本文关键词：鸡MTNR1A基因启动子克隆及活性分析

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【摘要】：MTNR1A基因编码褪黑激素受体1A,是影响鸡产蛋性状的候选基因。通过对MTNR1A基因启动子区的功能分析,有助于从分子水平上了解MTNR1A基因可能的调控序列及转录调控机制,对进一步了解褪黑激素参与生殖调控的作用机制也有一定作用。本试验以海兰褐壳蛋鸡为研究对象,采用PCR方法扩增了鸡MTNR1A基因5’调控区3134bp到205bp长度不同、下游引物相同的七个片段,对其进行克隆、测序后,构建了七个启动子报告基因表达载体,瞬时转染鸡卵泡膜细胞,应用双荧光素酶报告基因检测系统测定了荧光素酶相对活性,并对产生作用的区段进行生物信息学分析。同时,PCR扩增31只鸡MTNR1A基因5’调控区-941~+107区域进行测序,寻找其SNP位点,对SNP位点进行遗传学分析,并对突变前后基因序列进行生物信息学分析。结果表明:(1)-243~-39区段能表达MTNR1A基因启动子的基本活性。生物信息学分析表明,该区域包含TATA box、CCAAT box等典型的核心启动子元件。表明-243~-39区段对该基因的表达调控起重要作用。(2)启动子分析载体由-553~-39删除至-243~-39时,荧光素酶活性显著下降,表明-553~-243间有增强MTNR1A基因表达的作用元件。该区域存在多个SP1结合位点和USF结合位点,推测这两种结合位点对-553~-243区域活性增强起重要作用。(3)启动子分析载体由-1963~-39删除至-1525~-39时,荧光素酶结果显著升高,表明-1963~-1525间有降低MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的AP-1结合位点、HNF-1结合位点、USF结合位点及Arnt反式作用因子发挥降低启动子活性的作用。(4)启动子分析载体由-2373~-39删除至-1963~-39时,荧光素酶活性显著降低,表明从-2373~-1963区域中存在增强MTNR1A基因表达的作用元件。推测该区域的TATA box、AP-1结合位点、c-Myb结合位点、USF结合位点和Oct-1反式作用因子起到增强-2373~-1963区域活性的作用。(5)启动子-941~+107区域存在6个SNPs位点:-34(C→T),-100(T→G),-110(T→C),-126(C→T),-151(G→A),-538(T→G),处于Hardy-Weinberg平衡状态。其中2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。综上所述,本试验证明MTNR1A基因-553~-243和-2373~-1525区段是调控该基因表达的重要作用区段;5’调控区-941~+107存在2个突变可能造成转录因子结合位点的改变。
【关键词】：鸡 MTNR1A基因 启动子 SNPs
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 符号说明4-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1 引言11-21
• 1.1 启动子及其研究方法11-13
• 1.1.1 启动子概述11
• 1.1.2 启动子构成11-12
• 1.1.3 启动子活性检测和功能分析12-13
• 1.2 褪黑激素及受体的研究进展13-17
• 1.2.1 褪黑激素的发现、结构及分布13-14
• 1.2.2 褪黑激素的合成及对生殖的调控14-15
• 1.2.3 褪黑激素受体的发现及分类15-16
• 1.2.4 褪黑激素受体 1A的结构与功能16-17
• 1.3 褪黑激素受体 1A基因的研究进展17-20
• 1.3.1 褪黑激素受体 1A基因的结构17
• 1.3.2 褪黑激素受体 1A基因的表达17
• 1.3.3 褪黑激素受体 1A基因SNP研究及检测方法17-19
• 1.3.4 褪黑激素受体 1A基因在卵巢中的研究19-20
• 1.4 目的与意义20-21
• 2 材料与方法21-34
• 2.1 试验材料21-23
• 2.1.1 试验动物和样品采集21
• 2.1.2 主要仪器设备21
• 2.1.3 主要试剂及来源21-22
• 2.1.4 主要数据库和分析软件22
• 2.1.5 常用试剂的配制22-23
• 2.2 试验方法23-34
• 2.2.1 鸡血液基因组DNA提取23-24
• 2.2.2 MTNR1A 5’调控区启动功能分析24-32
• 2.2.2.1 启动子预测及启动子区缺失片段PCR扩增24-26
• 2.2.2.2 PCR产物检测及纯化回收26-27
• 2.2.2.4 连接产物转化感受态细胞27-28
• 2.2.2.5 菌液阳性鉴定及质粒DNA提取28-29
• 2.2.2.6 重组质粒的酶切鉴定及测序29
• 2.2.2.7 无内毒素质粒大提29-30
• 2.2.2.8 提取质粒浓度及质量检测30
• 2.2.2.9 鸡卵泡外膜细胞的分离培养30-31
• 2.2.2.10 质粒DNA转染试验31-32
• 2.2.2.11 双荧光素酶活性测定32
• 2.2.3 MTNR1A基因 5’调控区SNPs检测32-33
• 2.2.3.1 MTNR1A基因 5’调控区引物设计32-33
• 2.2.3.2 MTNR1A基因 5’调控区SNPs检测33
• 2.2.4 数据统计分析33-34
• 3 试验结果与分析34-43
• 3.1 MTNR1A启动子区启动活性检测结果与分析34-41
• 3.1.1 调控区域转录因子结合位点的预测34-35
• 3.1.2 启动子不同长度片段的PCR扩增35-36
• 3.1.3 启动子区片段报告基因分析载体的构建及检测36-37
• 3.1.4 鸡MTNR1A基因启动子区片段荧光素酶活性检测结果37-39
• 3.1.5 鸡MTNR1A基因启动子的生物信息学分析39-41
• 3.2 海兰褐壳蛋鸡MTNR1A基因 5’调控区SNPS检测及分析41-43
• 3.2.1 海兰褐壳蛋鸡MTNR1A基因 5’调控区SNPs检测结果41-42
• 3.2.2 SNPs位点的TFSEARCH分析42
• 3.2.3 MTNR1A基因 5’调控区SNPs位点群体遗传学分析42-43
• 4 讨论43-46
• 4.1 鸡MTNR1A启动子区启动功能分析43-44
• 4.2 鸡MTNR1A 5’调控区SNPS研究44-46
• 5 结论46-47
• 参考文献47-56
• 致谢56

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本文编号：818484