四种乳酸菌中低聚糖合成相关的基因的挖掘及其功能研究

发布时间：2017-09-09 11:30

  本文关键词：四种乳酸菌中低聚糖合成相关的基因的挖掘及其功能研究

  更多相关文章： 乳酸菌 全基因组 基因挖掘 表达验证

【摘要】：随着中国经济高速发展,人们生活水平的提高,对环境和健康的日益重视,食品安全问题俨然成为全社会关注的焦点,崇尚绿色,回归自然的饮食观念也随之形成,功能性低聚糖和蛋氨酸因其功能的多样性和独特性而备受关注。肠道微生态的紊乱是影响人们或动物健康水平的最主要原因之一,功能性低聚糖进入体内后不能被吸收,但能被肠道益生菌利用而大量增殖,抑制病原微生物的生长,改善微生态环境;蛋氨酸是人体必需的氨基酸,需求量较少,但蛋氨酸及其代谢产物可参与机体新陈代谢,提高机体免疫力和抗氧化能力,减少对抗生素等的依赖。伴随着生物技术步入21世纪,测序技术不断的发展,第二代测序因其通量大、精度高、信息量丰富的特点而被广泛的使用,而基于第二代全基因组测序的功能基因挖掘手段也逐渐成为研究的焦点。生物体的全基因组所承载的遗传信息包含巨大潜在的研究与经济价值,对其进行功能基因的挖掘成为重要的利用手段。因此,选取与合成功能性低聚糖和蛋氨酸的有关的酶类为验证对象,采用该方式对本课题组自主筛得的植物乳杆菌和干酪乳杆菌的全基因组测序信息,以及NCBI数据库上传的乳酸菌全基因组信息进行生物信息学分析来挖掘功能基因。本研究通过生物信息学的方法从乳酸菌的全基因组序列信息中挖掘出与功能性低聚糖合成相关的酶,α-葡萄糖基转移酶(α-GTF-pla、α-GTF-cas、α-GTF-bre),鼠李糖基转移酶(RHLase),β-呋喃果糖苷酶(β-FFase),蔗糖磷酸化酶(SPase);与蛋氨酸合成相关的酶,高丝氨酸-O-琥珀酰转移酶(MetA),通过PCR的方法克隆得到相应基因,成功构建大肠杆菌表达系统,但除β-呋喃果糖苷酶,蔗糖磷酸化酶外均生成包涵体。对α-GTF-pla进行诱导条件优化和复性未获得可溶性蛋白时,构建其乳酸乳球菌表达系统获得了其可溶性表达。功能验证结果表明,α-GTF-pla与β-呋喃果糖苷酶不具备其对应分解蔗糖的能力,蔗糖磷酸化酶则与其功能相对应。表明基于全基因组信息进行生物信息学分析来挖掘功能基因存在一些局限性。利用蔗糖磷酸化酶合成功能性低聚糖,进行酶学性质研究及底物筛选,仅D-半乳糖,麦芽糖和蔗糖能形成明显的低聚糖,与已知的蔗糖磷酸化酶受体范围存在一定差异性。利用D-半乳糖和蔗糖合成蜜二糖,进行条件优化和响应面分析,在底物浓度为60%,底物比例为1:2,反应温度为40℃,加纯化酶量为400μL(0.39 U/L)的条件下反应24h,可获得最高蜜二糖的产量为34.20±0.92 g/L。
【关键词】：乳酸菌 全基因组 基因挖掘 表达验证
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q811.4;TS201.3
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 1 前言11-33
• 1.1 功能性低聚糖研究进展11-21
• 1.1.1 低聚糖的功能11-13
• 1.1.2 常见功能性低聚糖的种类13-14
• 1.1.3 功能性低聚糖的应用14-15
• 1.1.4 合成方式15-21
• 1.2 蛋氨酸研究进展21-30
• 1.2.1 蛋氨酸的性质21-22
• 1.2.2 生理功能22-23
• 1.2.3 吸收与代谢途径23-26
• 1.2.4 蛋氨酸的应用26-27
• 1.2.5 蛋氨酸生产27-29
• 1.2.6 高产蛋氨酸菌株的构建29-30
• 1.3 功能基因的挖掘30-32
• 1.3.1 基因组学介绍31
• 1.3.2 乳酸菌基因组学研究31-32
• 1.4 本研究的目的和意义32-33
• 2 材料与方法33-59
• 2.1 材料33-37
• 2.1.1 菌株和质粒33
• 2.1.2 培养基及试剂配制33-35
• 2.1.3 酶与试剂35-36
• 2.1.4 主要仪器设备36
• 2.1.5 试剂盒36
• 2.1.6 分子量标准36-37
• 2.2 方法37-59
• 2.2.1 功能基因的挖掘37
• 2.2.2 引物设计37-39
• 2.2.3 ɑ-GTF-pla基因的克隆39-44
• 2.2.4 ɑ-GTF-pla的表达表达验证44-53
• 2.2.4.1 重组表达载体的构建44-47
• 2.2.4.2 重组表达载体的转化E.coli DH5α47
• 2.2.4.3 重组表达载体的筛选与鉴定47-48
• 2.2.4.4 重组表达载体转化 BL2148
• 2.2.4.5 重组大肠杆菌的诱导表达48
• 2.2.4.6 诱导表达产物SDS-PAGE分析48-49
• 2.2.4.7 α-GTF酶活检测49-50
• 2.2.4.8 重组蛋白含量的测定50
• 2.2.4.9 诱导表达产物的纯化50
• 2.2.4.10 包涵体复性50-51
• 2.2.4.11 α-GTF-pla的表达条件优化51-52
• 2.2.4.12 α-GTF-pla在乳酸乳球菌中的表达52-53
• 2.2.5 α-GTF-cas的克隆与表达验证53-54
• 2.2.6 α-GTF-bre的克隆与表达验证54
• 2.2.7 FFase-pla的克隆及表达验证54-55
• 2.2.8 RHL的克隆与表达验证55
• 2.2.9 metA的克隆与表达验证55
• 2.2.10 SPase在大肠杆菌中的表达验证55-57
• 2.2.11 SPase合成功能性低聚糖研究57-59
• 3 结果与分析59-101
• 3.1 功能基因的挖掘59-61
• 3.1.1 全基因组测序挖掘功能基因59-61
• 3.1.2 数据库中 α-GTF的挖掘61
• 3.2 引物设计61-62
• 3.3 α-gtf-pla基因的克隆62-68
• 3.3.1 植物乳杆菌基因组DNA的提取62
• 3.3.2 α-GTF-pla的PCR扩增与产物检测62-63
• 3.3.3 α-gtf-pla基因PCR产物的回收63
• 3.3.4 植物乳杆菌 α-gtf-pla基因PCR产物测序63-64
• 3.3.5 克隆载体 α-gtf-pla/pMD-18T构建与鉴定64
• 3.3.6 α-gtf-pla完整序列的生物信息学分析64-68
• 3.4 α-gtf-pla基因的表达验证68-73
• 3.4.1 α-GTF-pla基因表达载体的构建与鉴定68-69
• 3.4.2 α-GTF-pla基因的表达与分析69
• 3.4.3 α-GTF-pla包涵体的复性69-70
• 3.4.4 α-GTF-pla表达条件的优化70-71
• 3.4.5 α-GTF-pla在乳酸乳球中的表达验证71-73
• 3.5 α-gtf-cas基因的克隆与表达验证73-77
• 3.5.1 干酪乳杆菌 α-GTF基因的克隆73-74
• 3.5.2 表达载体 α-gtf-cas/pET-32a的构建74-75
• 3.5.3 α-gtf-cas基因在大肠杆菌中的表达75-76
• 3.5.4 表达载体 α-gtf-cas/pBM02的构建76-77
• 3.6 α-gtf-bre基因的克隆与表达验证77-79
• 3.6.1 α-gtf-bre基因的克隆77-78
• 3.6.2 表达载体 α-gtf-bre/pET-32a的构建78
• 3.6.3 α-gtf-bre基因在大肠杆菌中的表达验证78-79
• 3.7 三株乳酸菌中 α-gtf基因的比较分析79-80
• 3.8 FFase基因的克隆与表达验证80-83
• 3.8.1 FFase基因的克隆80-81
• 3.8.2 表达载体FFase/pET-32a的构建81-82
• 3.8.3 FFase基因在大肠杆菌中的表达验证82-83
• 3.9 RHL基因的克隆与表达验证83-85
• 3.9.1 RHL基因的克隆83-84
• 3.9.2 表达载体RHL/pET-32a的构建84
• 3.9.3 RHL基因在大肠杆菌中的表达验证84-85
• 3.10 MetA基因的克隆与表达验证85-87
• 3.10.1 MetA基因的克隆85-86
• 3.10.2 MetA基因表达载体MetA/pET-32a的构建86
• 3.10.3 MetA基因在大肠杆菌中的表达验证86-87
• 3.11 SPase基因的克隆与表达验证87-90
• 3.11.1 SPase基因的克隆87-88
• 3.11.2 表达载体SPase/pET-32a的构建88-89
• 3.11.3 SPase基因在大肠杆菌中的表达验证89
• 3.11.4 SPase的纯化分析89-90
• 3.11.5 SPase酶活测定90
• 3.12 SPase酶学性质研究90-94
• 3.12.1 SPase最适反应温度90-91
• 3.12.2 酶的最适反应pH91
• 3.12.3 金属离子对SPase酶活的影响91-92
• 3.12.4 温度对SPase稳定性的影响92-93
• 3.12.5 pH对SPase稳定性的影响93
• 3.12.6 SPase酶反应常数测定93-94
• 3.13 SPase合成功能性低聚糖94-101
• 3.13.1 SPase合成功能性低聚糖底物的筛选94-95
• 3.13.2 蜜二糖合成条件的影响95-98
• 3.13.3 正交分析98-101
• 4 讨论与结论101-108
• 4.1 讨论101-107
• 4.1.1 基因挖掘与验证101-102
• 4.1.2 大肠杆菌表达系统中包涵体的形成102-104
• 4.1.3 乳酸菌表达系统104-106
• 4.1.4 SPase合成功能性低聚糖106-107
• 4.2 结论107-108
• 致谢108-109
• 参考文献109-121
• 附录121

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：820188