贵州省猪源大肠杆菌四环素耐药基因检测及转移的研究

发布时间：2017-09-10 03:51

  本文关键词：贵州省猪源大肠杆菌四环素耐药基因检测及转移的研究

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【摘要】：目前抗菌药物的不合理使用导致细菌的耐药性问题越来越严重,这大大的增加了抗菌药物对细菌性疾病防治的难度。为了解贵州省规模养殖场猪源大肠杆菌对四环素类抗生素的耐药水平和四环素耐药基因的分子流行情况,探讨细菌耐药性获得及传播方式,建立大肠杆菌四环素耐药基因水平转移模型,了解四环素耐药基因在细菌间的转移频率和方式;同时探讨解决大肠杆菌耐药性问题的方法,采用中药消除耐药质粒降低细菌耐药性,为猪大肠杆菌病的防治和抗菌新药的研究提供帮助。本研究参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)标准,采用微量肉汤稀释法检测大肠杆菌分离株对四环素类抗生素等12种药物的耐药情况,并通过PCR扩增方法检测其携带7种四环素耐药基因情况。结果表明:160株大肠杆菌对四环素、金霉素、土霉素、米诺环素、地美霉素、强力霉素、卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、磺胺嘧啶和头孢唑林的耐药率分别为:94.36%、92.96%、100%、18.31%、70.42%、59.15%、66.29%、48.76%、29.82%、21.62%、91.67%、50.00%。大肠杆菌分离株最少对3种药物耐药,最多对11种药物均耐药,多重耐药率达100%。四环素耐药基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetM和tetO的检出率分别为60.63%、74.38%、51.88%、11.88%、0、64.38%和0,四环素耐药基因的检出率与其对四环素的耐药性呈正相关。四环素体外诱导鉴定耐药基因对大肠杆菌耐药水平的影响结果表明,在有药物压力下,含tetB基因的大肠杆菌菌株可以从敏感菌快速诱导成高度耐药菌,tetB基因是影响大肠杆菌对四环素高度耐药的重要因素之一。将含tetB基因的耐药质粒向大肠杆菌DH5α进行转化时成功获得转化子,说明大肠杆菌中四环素耐药质粒可以以转化的方式向大肠杆菌DH5α进行转移tetB基因,且能在受体菌中稳定编码外排泵蛋白表达出四环素耐药性。在tetB接合转移实验中,大肠杆菌EC1和EC2向沙门氏菌S1接合转移频率分别为1.68x10-3和2.24x10-3,而两株大肠杆菌与金黄色葡萄球菌进行接合实验时未获得接合子,表明大肠杆菌可能不能以接合的方式向金黄色葡萄球菌转移四环素耐药性。采用中药消除耐药质粒从而降低质粒介导的耐药性实验结果表明,经1/2MIC(最小抑菌浓度)的黄连、金银花、艾叶、五倍子作用24h后对大肠杆菌耐药性的消除率分别为5.34%、2.67%、10.01%、12.53%;作用48h后其消除率分别为7.27%、3.47%、10.93%、13.68%。研究耐药性消除效果最好的五倍子大肠杆菌消除子耐药质粒的丢失情况和对抗菌药物敏感性的恢复情况时发现,消除子的质粒丢失了1~3条条带,对多种抗菌药物的MIC值出现下降,对四环素、庆大霉素、卡那霉素和头孢唑林的敏感性除个别菌恢复至中介外,均从耐药恢复至敏感。
【关键词】：大肠杆菌 四环素 耐药性 耐药基因 转移 中药 质粒 消除
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-21
• 1. 大肠杆菌的研究现状10-12
• 1.1 大肠杆菌的危害10-11
• 1.2 大肠杆菌的耐药性研究11-12
• 2. 大肠杆菌对抗菌药物的耐药机制12-16
• 2.1 细菌对四环素类抗生素耐药机制的研究13-14
• 2.2 四环素类抗生素的结构和理化性质14
• 2.3 细菌对四环素类抗生素耐药机制的研究14-16
• 3. 耐药基因转移的研究现状16-18
• 4. 中药消除细菌耐药性的研究18-19
• 5. 本研究的目的与意义19-20
• 6. 主要研究内容20-21
• 第一章 猪源大肠杆菌耐药性和耐药基因检测21-37
• 1. 实验材料21-23
• 1.1 药物与试剂21
• 1.2 实验仪器21-22
• 1.3 引物22-23
• 1.4 实验菌株23
• 2. 实验方法23-30
• 2.1 大肠杆菌的来源23-24
• 2.2 大肠杆菌的分离鉴定24
• 2.3 四环素类抗生素的药敏实验24-27
• 2.4 四环素tet耐药基因检测27-30
• 3. 结果30-35
• 3.1 分离、鉴定结果30
• 3.2 耐药性的检测结果30-33
• 3.3 耐药基因的检测结果33-35
• 4.结果讨论35-37
• 第二章 大肠杆菌四环素耐药基因的转移37-53
• 1. 实验材料37-39
• 1.1 实验试剂37-38
• 1.2 主要药品38
• 1.3 实验仪器38-39
• 1.4 试验菌株39
• 2. 实验方法39-43
• 2.1 体外诱导鉴定耐药基因对大肠杆菌耐药水平的影响39-41
• 2.2 大肠杆菌四环素耐药基因转移41-43
• 3.实验结果43-50
• 3.1 四环素药物诱导前大肠杆菌的MIC值43-44
• 3.2 转化转移实验的结果44-47
• 3.3 接合转移实验结果47-50
• 4. 结果讨论50-53
• 第三章 中药消除大肠杆菌耐药性53-65
• 1 实验材料53-54
• 1.1 药物与试剂53
• 1.2 仪器和试剂53-54
• 1.3 实验菌株54
• 2. 实验方法54-56
• 2.1 中药药液的制备54
• 2.2 中药提取液对致病性大肠杆菌MIC值的测定54-55
• 2.3 耐药性的消除实验55
• 2.4 耐药性消除子的筛选与鉴定55
• 2.5 耐药性消除前后菌株质粒的提取和电泳55
• 2.6 耐药性消除前后的耐药表型变化55-56
• 3. 结果与分析56-63
• 3.1 耐药性的测定结果56
• 3.2 不同中药提取液对大肠杆菌最小抑菌浓度MIC值的测定结果56-57
• 3.3 耐药性消除实验结果57-58
• 3.4 耐药性消除前后菌株质粒检测结果58-59
• 3.5 耐药性消除前后的耐药表型变化59-63
• 4 结果讨论63-65
• 实验结论65-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-74
• 附录74-75
• 缩略词表75-77
• 实验图77

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