流产布鲁菌pyk和ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

发布时间：2017-09-12 23:32

  本文关键词：流产布鲁菌pyk和ppdk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

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【摘要】：布鲁菌是一种人畜共患病原菌,兼性胞内寄生,革兰氏染色呈阴性,感染后主要导致人的波状热和动物的流产。布鲁菌缺少典型的毒力因子,如细胞溶素、外毒素、荚膜等,其致病性主要表现为入侵靶细胞并在胞内长期存活的能力。近年来,胞内菌的碳代谢与细菌毒力之间的关系成为研究的热点,李斯特杆菌、志贺氏菌、结核杆菌等胞内菌能够通过调控自身代谢来适应胞内恶劣的生存环境,如低pH,营养匮乏、氧化应激等,而目前对布鲁菌碳代谢与毒力的关系知之甚少。本实验室前期利用信号标签随机突变(STM)技术筛选到了两个与布鲁菌毒力相关的碳代谢基因,即丙酮酸激酶基因(pyk,locus tag BAB_RS24320)和丙酮酸磷酸双激酶基因(ppdk,locus tag BAB_RS18420)。为了进一步研究pyk和ppdk基因功能,本研究利用同源重组方法构建了pyk和ppdk定向缺失株,通过比较基因缺失后布鲁菌的生物学特性变化来研究基因的功能,其中对pyk缺失株的研究更加深入。当pyk基因缺失后,生长曲线结果显示布鲁菌生长速度减慢,尤其在营养条件匮乏的条件下,减慢的趋势更加显著;耐受性实验结果显示Δpyk缺失株对氧化剂的耐受能力降低,然而对低pH、大牛血清、多粘菌素B的耐受能力与野毒相当;胞内存活实验结果显示Δpyk在巨噬细胞内的存活能力降低,并利用免疫荧光实验进一步揭示了Δpyk在巨噬细胞内减弱排斥溶酶体降解的能力;动物实验结果显示Δpyk缺失株不能在小鼠体内建立慢性感染,这与Δpyk缺失株胞内存活能力减弱是密切相关的,表明pyk基因确实与布鲁菌的毒力密切相关。当ppdk缺失后,生长曲线结果显示布鲁菌生长速度减慢;耐受实验结果显示Δppdk对多粘菌素B和大牛血清的耐受能力降低,然而对双氧水耐受能力同野毒相当;胞内存活实验结果显示在巨噬细胞内的存活能力降低,同动物实验中Δppdk对小鼠的致病力减弱的结果相符,表明ppdk基因也与布鲁菌毒力密切相关。综上,本研究通过构建布鲁菌碳代谢相关的Δpyk和Δppdk定向突变株,并测定缺失株主要的生物学特性变化,结果证明了pyk和ppdk是布鲁菌毒力密切相关的基因,为布鲁菌碳代谢与毒力关系的研究提供重要的理论研究资料,为布鲁菌代谢缺陷型减毒活疫苗研究奠定了基础。
【关键词】：流产布鲁菌 丙酮酸激酶 丙酮酸磷酸双激酶 毒力
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 布鲁菌病的概述12
• 1.1.1 布鲁菌病的流行12
• 1.1.2 布鲁菌病原学特征12
• 1.2 布鲁菌致病机制的研究进展12-19
• 1.2.1 布鲁菌逃避宿主免疫监视12-13
• 1.2.2 布鲁菌的胞内移行途径13-15
• 1.2.3 布鲁菌主要的毒力因子简述15-17
• 1.2.4 布鲁菌的效应分子17-18
• 1.2.5 胞内菌碳代谢与毒力关系的研究进展18-19
• 1.3 本研究的目的和意义19-20
• 第二章 布鲁菌pyk缺失株的构建及其生物学特性分析20-32
• 2.1 材料与方法20-25
• 2.1.1 菌种与主要试剂20
• 2.1.2 主要仪器设备20
• 2.1.3 主要溶液的配制20-21
• 2.1.4 引物设计21
• 2.1.5 自杀质粒和互补质粒的构建21-22
• 2.1.6 缺失株和互补株的构建22
• 2.1.7 Western blot实验22-23
• 2.1.8 细菌RNA的提取及qRT-PCR的分析23
• 2.1.9 TSB培养基和基础培养基中生长曲线的测定23
• 2.1.10 耐受性实验23-24
• 2.1.11 间接免疫荧光实验24
• 2.1.12 胞内存活实验24-25
• 2.1.13 对小鼠致病力分析25
• 2.2 结果25-30
• 2.2.1 质粒构建结果25-26
• 2.2.2 缺失株和回复株构建结果26
• 2.2.3 TSB培养基和基础培养基中生长曲线测定结果26-27
• 2.2.4 胞内存活能力测定27-28
• 2.2.5 间接免疫荧光实验结果28-29
• 2.2.6 耐受性实验结果29
• 2.2.7 对小鼠致病力分析结果29-30
• 2.3 讨论30-32
• 第三章 布鲁菌ppdk缺失株的构建及生物学特性分析32-39
• 3.1 材料与方法32-34
• 3.1.1 质粒、菌种及试剂32
• 3.1.2 引物设计32
• 3.1.3 自杀质粒构建32-33
• 3.1.4 缺失株的构建33
• 3.1.5 细菌RNA的提取及qRT-PCR分析33
• 3.1.6 生长曲线测定33
• 3.1.7 耐受性实验33-34
• 3.1.8 胞内存活试验34
• 3.1.9 小鼠致病力分析34
• 3.2 结果34-37
• 3.2.1 质粒构建34-35
• 3.2.2 缺失株构建35
• 3.2.3 生长曲线测定结果35-36
• 3.2.4 胞内存活试验分析36
• 3.2.5 耐受性试验结果36-37
• 3.2.6 缺失株对小鼠的致病力分析37
• 3.3 讨论37-39
• 第四章 全文结论39-40
• 参考文献40-50
• 致谢50-51
• 作者简历51

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本文编号：840180