铁皮石斛糖基转移酶基因分析及β-1,3葡聚糖合成酶基因的克隆

发布时间：2017-09-13 01:50

  本文关键词：铁皮石斛糖基转移酶基因分析及β-1,3葡聚糖合成酶基因的克隆

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【摘要】：铁皮石斛,属于兰科石斛属。为我国传统名贵中药材,具有很高的药用价值。它的茎有镇痛,消肿等作用,有效的增强机体的免疫活性。随着铁皮石斛生物学研究的深化,对于研究者来说控制重要的农艺性状的功能基因是有研究价值的。而其主要的药用活性物质是多糖,由于多糖结构、组分复杂,其代谢途径成为研究难点。于是研究人员从多糖合成相关的酶入手,探究多糖代谢途径。本研究通过全基因组分析,研究铁皮石斛多糖合成相关的基因。将铁皮石斛基因组序列应用Genescan对潜在基因进行挖掘;在KEGG上下载拟南芥、番茄的糖代谢途径的酶基因;分别用拟南芥和番茄的酶基因与铁皮石斛基因组进行LocalBlast,对两部分结果在进行比较、聚类分析,并预测多糖合成途径。结合RACE技术,进行铁皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶部分序列克隆。首先,将拟南芥的β-1,3葡聚糖合成酶基因与铁皮石斛基因组进行本地Blast,得到5条与已知植物的β-1,3葡聚糖合成酶基因相似的scaffold;将5条scaffold在NCBI中进行ORF注释;从中选取3条片段进行保守区域扩增;其中两条进行3’端扩增,而后其中一条进行5’端扩增,克隆得到β-1,3葡聚糖合成酶部分序列。通过最后系统进化树结果显示,铁皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶基因与水稻相似度最高,达到近80%。通过本研究推测铁皮石斛多糖合成途径,是由核酸糖代谢提供单糖供体,蔗糖等寡糖作为主干链,在糖基转移酶基因作用下单糖添加到寡糖链,构成糖单元,糖单元再聚合为多糖;克隆得到铁皮石斛β-1,3葡聚糖合成酶基因部分序列,为后续研究该基因功能、表达分析、以及研究多糖代谢途径奠定研究基础。
【关键词】：铁皮石斛 基因克隆 β-1 3葡聚糖合成酶
【学位授予单位】：云南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 缩为略词表10-11
• 1.引言11-20
• 1.1 铁皮石斛概述11-14
• 1.1.1 铁皮石斛概述11
• 1.1.2 铁皮石斛多糖药理作用11-12
• 1.1.3 铁皮石斛含糖量12-13
• 1.1.4 铁皮石斛多糖组分及结构分析13-14
• 1.2 糖基转移酶概述14-17
• 1.2.1 糖基转移酶概念及分类14-15
• 1.2.2 UGT基因家族研究进展15-16
• 1.2.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因16-17
• 1.3 全基因组研究技术17
• 1.4 基因克隆技术17-19
• 1.5 本研究的实际意义19-20
• 2.材料、试剂及仪器20-21
• 2.1 材料20
• 2.2 试剂20
• 2.3 仪器20-21
• 3.方法21-31
• 3.1 铁皮石斛全基因组糖基转移酶分析21-22
• 3.1.1 铁皮石斛全基因组序列下载21
• 3.1.2 基因预测21
• 3.1.3 拟南芥和番茄糖代谢途径相关基因序列下载21-22
• 3.1.4 数据处理22
• 3.2 铁皮石斛基因组数据整合22
• 3.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因序列的探寻22
• 3.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因保守序列扩增验证22-27
• 3.4.1 RNA提取22-23
• 3.4.2 反转录23
• 3.4.3 引物设计23-24
• 3.4.4 PCR扩增体系24
• 3.4.5 PCR扩增程序24-25
• 3.4.6 PCR产物切胶回收25
• 3.4.7 连接25-26
• 3.4.8 转化26
• 3.4.9 质粒提取26-27
• 3.4.10 酶切验证27
• 3.5 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3'RACE27-29
• 3.5.1 RNA提取27
• 3.5.2 反转录27
• 3.5.3 引物设计27-28
• 3.5.4 PCR体系和程序28-29
• 3.5.5 切胶回收、连接、转化、质粒提取及酶切验证29
• 3.6 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 5’RACE29-31
• 3.6.1 RNA提取29
• 3.6.2 反转录29
• 3.6.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 5’RACE PCR扩增29-30
• 3.6.4 切胶回收、连接、转化、质粒提取及酶切验证30-31
• 4 结果31-48
• 4.1 铁皮石斛全基因组糖基转移酶基因分析31-37
• 4.1.1 拟南芥、番茄、水稻基因与铁皮石斛基因LocalBlast结果31
• 4.1.2 糖基转移酶基因系统进化关系31-35
• 4.1.3 铁皮石斛多糖合成途径预测35-37
• 4.2 β-1,3 葡聚糖基因的保守序列探寻37-38
• 4.2.1 铁皮石斛基因组序列本地Blast37
• 4.2.2 NCBI注释比对得到的scaffold37-38
• 4.3 β-1,3 葡聚糖基因保守区域扩增38-42
• 4.3.1 RNA提取38-39
• 4.3.2 叶片与茎的扩增39
• 4.3.3 β-1,3 葡聚糖基因保守序列扩增39-40
• 4.3.4 β-1,3 葡聚糖基因保守序列转化40
• 4.3.5 β-1,3 葡聚糖基因保守序列菌落PCR验证40-41
• 4.3.6 β-1,3 葡聚糖基因保守序列质粒提取41
• 4.3.7 β-1,3 葡聚糖基因保守序列酶切41-42
• 4.3.8 β-1,3 葡聚糖基因保守序列测序42
• 4.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE42-46
• 4.4.1 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE PCR42-43
• 4.4.2 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE转化43
• 4.4.3 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RAC菌落PCR验证43-44
• 4.4.4 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE质粒提取44
• 4.4.5 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE酶切44-45
• 4.4.6 β-1,3 葡聚糖合成酶基因 3’RACE测序45-46
• 4.5 β-1,3 葡聚糖基因的5’RACE46-48
• 5.讨论48-51
• 5.1 铁皮石斛多糖合成途径48-49
• 5.2 β-1,3 葡聚糖基因基因克隆49-51
• 5.2.1 RNA提取49
• 5.2.2 RACE技术49-50
• 5.2.3 蓝白斑筛选50-51
• 6.结论51-52
• 参考文献52-60
• 附录 1：试剂及溶液配制60-61
• 附录 2：序列峰图61-63
• 附录 3：拟南芥、番茄糖分别与铁皮石斛基因组LocalBlast结果63-73
• 致谢73-74
• 作者简介74

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