Lux发光基因标记大肠杆菌模型的构建及其生物膜的研究

发布时间：2017-09-13 04:03

  本文关键词：Lux发光基因标记大肠杆菌模型的构建及其生物膜的研究

  更多相关文章： lux基因 大肠杆菌 生物膜 D-甘露糖

【摘要】：Lux发光基因可编码合成荧光素酶,进而催化底物进行发光反应,产生波长约为450-490nm的可见蓝绿光,其作为报告基因被迅速地应用于在线观测、环境监测、食品安全控制、活体动物检测等多种研究领域。细菌生物膜是细菌对恶劣环境产生的应激反应而形成的一种自我保护状态,细菌形成生物膜后难以被除杀灭,给食品加工、医疗卫生等领域带来危害和难题。本研究将质粒pHSG396-P.luxCDABE(携带发光光杆状菌lux基因片段)导入大肠杆菌DH5α,以检测发光情况和酶切电泳验证等手段,筛选出成功表达发光的重组大肠杆菌,成功构建形成生物膜能力良好的重组发光大肠杆菌模型。对重组发光大肠杆菌的生理特性及生物膜与发光强度的关系进行了深入研究,试验得出以下结论:1.重组发光大肠杆菌的生理特性:(1)以新鲜LB液体培养基培养重组发光大肠杆菌,测定其生长曲线和发光曲线。结果显示,重组发光大肠杆菌在培养的0-3 h为调整期,4-8 h为对数期,第9 h进入稳定期;在调整期和对数期初期发光微弱,进入对数期后,发光强度快速增长,在第9 h达到培养阶段的最大发光值2510 RLU,进入稳定期后,发光强度逐渐减弱。(2)不同的培养环境(IPTG浓度、pH、Cml浓度、癸醛浓度、温度)下,测定重组发光大肠杆菌的生长OD600nm值和发光强度。结果显示,IPTG加入量小于0.2 mg/mL时,对发光强度的促进作用微弱,超过这个量则对发光强度起到了抑制作用;其在pH 5-9范围内能够发光,pH 7时生长和发光强度最大,pH 8弱碱性环境中发光强度高于pH 6弱酸性环境(生长浓度相同);Cml添加量为0-37.5μg/mL时,对其生长和发光强度影响微弱,超过此范围,则对生长有一定抑制作用;癸醛的添加对发光强度无促进作用;在37℃下,其生长和发光强度达到最大值,最高耐受温度为43℃;室温下,前15 min发光强度呈下降趋势,之后趋于平缓,在2 h内,发光强度始终处于400 RLU以上。2.重组发光大肠杆菌生物膜与发光强度的关系:(1)在四种因素(pH、D-甘露糖、菌悬液浓度、Cml浓度)条件下培养重组发光大肠杆菌生物膜,以结晶紫染色法和测定发光强度法对生物膜的生成量进行测定。结果显示,pH 8的弱碱性条件比pH 7的中性条件更利于生物膜的生长;D-甘露糖为培养重组发光大肠杆菌生物膜所必需,添加量为2.0%时,生物膜形成量最大;菌悬液OD600nm值为0.3时,为最佳配比,最利于生物膜的形成,过高或过低均不利于生物膜的生长;Cml浓度为12.5μg/mL时,为本次试验培养重组发光大肠杆菌生物膜的最适浓度。(2)将发光强度法得到的数据与结晶紫染色法数据进行回归分析。结果显示,两种方法得到的数据线性相关性良好(R-Sq90%),说明在适宜的培养条件下,发光强度法同样可以衡量细菌生物膜的生成量。
【关键词】：lux基因 大肠杆菌 生物膜 D-甘露糖
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文献综述12-23
• 1.1 生物发光12-13
• 1.1.1 发光细菌12
• 1.1.2 发光细菌发光机理12-13
• 1.1.3 发光细菌的lux系统13
• 1.2 细菌生物膜13-16
• 1.2.1 细菌生物膜的特点14
• 1.2.2 生物膜的形成14-16
• 1.3 Lux发光基因和细菌生物膜的研究现状16-21
• 1.3.1 lux发光系统的发展16
• 1.3.2 lux基因的应用特性研究16-18
• 1.3.3 lux基因作为标记基因和报告基因的应用18-19
• 1.3.4 lux基因与其他报告基因的比较19
• 1.3.5 lux系统的优缺点19-20
• 1.3.6 细菌生物膜的体外研究现状20-21
• 1.4 目的意义和研究内容21-23
• 1.4.1 研究目的意义21
• 1.4.2 研究内容21-22
• 1.4.3 技术路线22-23
• 第二章 产生物膜大肠杆菌的筛选和重组发光大肠杆菌模型的构建及验证23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 材料与方法23-27
• 2.2.1 供试菌株与质粒23-24
• 2.2.2 酶、试剂、材料和培养基24
• 2.2.3 主要试验仪器与设备24-25
• 2.2.4 试验方法25-27
• 2.3 结果分析27-28
• 2.3.1 产生物膜大肠杆菌的选择27
• 2.3.2 重组发光大肠杆菌的验证27-28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 Lux发光基因大肠杆菌模型生理特性研究29-37
• 3.1 引言29
• 3.2 材料与方法29-31
• 3.2.1 试验菌株与试剂29
• 3.2.2 主要试验仪器与设备29-30
• 3.2.3 试验方法30-31
• 3.3 结果分析31-35
• 3.3.1 重组发光大肠杆菌生长曲线与发光曲线的测定31-32
• 3.3.2 IPTG对重组发光大肠杆菌生长和发光强度的影响32
• 3.3.3 pH对重组发光大肠杆菌生长和发光强度的影响32-33
• 3.3.4 Cml浓度对重组发光大肠杆菌生长和发光强度的影响33
• 3.3.5 癸醛浓度对重组发光大肠杆菌发光强度的影响33-34
• 3.3.6 温度对重组发光大肠杆菌生长和发光强度的影响34-35
• 3.3.7 重组发光大肠杆菌发光稳定性测定35
• 3.4 小结35-37
• 第四章 Lux发光基因大肠杆菌模型生物膜产生量和发光强度关系研究37-46
• 4.1 引言37
• 4.2 材料与试剂37-38
• 4.2.1 试验材料37-38
• 4.2.2 主要仪器与设备38
• 4.3 试验方法38-40
• 4.3.1 大肠杆菌生物膜的培养38-39
• 4.3.2 测定生物膜发光强度39
• 4.3.3 结晶紫染色法测定生物膜39
• 4.3.4 不同培养条件对大肠杆菌生物膜的影响39-40
• 4.4 结果与分析40-44
• 4.4.1 pH对大肠杆菌生物膜的影响40-41
• 4.4.2 D-甘露糖添加量对大肠杆菌生物膜的影响41-42
• 4.4.3 菌悬液浓度对大肠杆菌生物膜的影响42-43
• 4.4.4 Cml浓度对大肠杆菌生物膜的影响43-44
• 4.4.5 结晶紫染色法和发光强度法回归分析44
• 4.5 小结44-46
• 第五章 结论与展望46-47
• 5.1 结论46
• 5.2 论文创新点46
• 5.3 展望46-47
• 参考文献47-51
• 附录51-52
• 致谢52-53
• 作者简介53

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 ;生物膜的奥秘[J];科技广场;2002年11期

2 陈Oz ,张旭家;中国生物膜研究新进展——记“21世纪生物膜研究”香山会议和第8次全国暨2003海内外生物膜学术研讨会[J];科学通报;2003年09期

3 ;一次成功的生物膜学术研讨会——第八次全国暨2003海内外生物膜学术研讨会[J];生物化学与生物物理进展;2003年03期

4 黄有国;一次成功的生物膜学术研讨会——第八次全国暨2003海内外生物膜学术研讨会[J];中国生物化学与分子生物学报;2003年03期

5 ;一次成功的生物膜学术研讨会——第八次全国暨2003海内外生物膜学术研讨会[J];生物物理学报;2003年02期

6 周廷冲;;生物膜在医学研究中的重要性(第二部分)[J];生理科学进展;1978年02期

7 王洪春;;生物膜学术会议简报[J];植物生理学通讯;1979年02期

8 吴显荣;;生物膜[J];植物杂志;1981年02期

9 张志鸿;;生物膜在日本的研究概况[J];国外医学(分子生物学分册);1982年04期

10 杨福愉;生物膜研究是一个有很大潜力的领域[J];自然辩证法通讯;1985年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 郑波;;生物膜研究进展[A];第8届全国抗菌药物临床药理学术会议暨北京大学临床药理研究所成立三十周年论文集[C];2010年

2 Michael Gittins;;生物膜及其清除[A];中华护理学会第7届消毒供应中心发展论坛大会资料[C];2011年

3 于树云;宋诗铎;;万古霉素联合盐酸氨溴索对表葡菌生物膜干预作用的实验研究[A];中华医学会第七届全国呼吸道感染学术大会暨第一届多学科抗感染治疗学术研讨会论文汇编[C];2011年

4 隋森芳;;从分子到细胞——生物膜研究发展的动力[A];第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编[C];1999年

5 陈Oz;;生物膜与后基因组时代[A];后基因组时代的基因功能研究——青年科学家论坛第八十次活动论文集[C];2003年

6 吴骏逸;陆维昌;陈邦林;;新型悬浮材料上的生物膜降解氮的研究[A];中国化学会第十届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2004年

7 于树云;宋诗铎;;万古霉素联合盐酸氨溴索对表葡菌生物膜干预作用的实验研究[A];中华医学会呼吸病学年会——2011（第十二次全国呼吸病学学术会议）论文汇编[C];2011年

8 唐梦丹;郑建锋;赵敬军;;曲霉生物膜研究进展[A];2012全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2012年

9 李剑锋;张红东;邱枫;杨玉良;;离散变分原则在生物膜形变模拟中的应用[A];2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题B：高分子理论、计算与模拟[C];2013年

10 叶树集;马素兰;李红春;;生物膜上胆固醇传输动力学的非线性光谱研究[A];中国化学会第十四届胶体与界面化学会议论文摘要集-第1分会：表面界面与纳米结构材料[C];2013年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 孙琪;顶级专家聚蓉 研讨防治“生物膜”[N];四川日报;2011年

2 记者 盛利;细菌生物膜研究将有效破解细菌抗药性[N];科技日报;2011年

3 本报记者 常丽君;掌控细胞悄悄话 攻破细菌生物膜[N];科技日报;2012年

4 常丽君;新系统能将生物膜改造成生物材料工厂[N];科技日报;2014年

5 实习生 操秀英;科学家发明细菌膜检测新设备[N];科技日报;2007年

6 田建军;生物膜为污水处理提供新模式[N];经济参考报;2004年

7 辽君;生物膜让“老慢支”久治不愈[N];卫生与生活报;2003年

8 本报记者 李颖;生物膜+微孔曝气 净化水体初战告捷[N];中国花卉报;2006年

9 中国水产科学研究院;海水工厂化养殖循环水净化系统中生物膜快速构建方法[N];中国渔业报;2013年

10 唐伟;生物膜研究领域的新收获[N];科技日报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 孙静;表面附着、休眠对白色念珠菌生物膜滞留菌形成的影响及滞留菌相关基因的初步筛选[D];山东大学;2015年

2 李培谦;黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucuifimViiiw)生物膜的形成及相关基因功能分析[D];广西大学;2015年

3 陈颖;肺癌生物材料植入白色念珠菌—表皮葡萄球菌生物膜的形成与宿主免疫功能的关系[D];昆明医科大学;2015年

4 史惠卿;亚-MIC头孢他啶、头孢哌酮对大肠埃希菌生物膜形成的影响及机制研究[D];第三军医大学;2013年

5 王小燕;气管导管材料表面细菌与真菌混合生物膜形成及真菌密度感应分子对混合生物膜的作用研究[D];昆明医科大学;2015年

6 王培培;生防枯草芽胞杆菌NCD-2ko株丰产素合成和生物膜形成相关基因的功能分析[D];河北农业大学;2015年

7 陆笑;LuxS/AI-2密度感应信号影响草绿色链球菌生物膜致病力的研究[D];南方医科大学;2015年

8 祝泽兵;供水管网中的耐氯菌群及其耐氯机制研究[D];哈尔滨工业大学;2015年

9 徐志辉;解淀粉芽孢杆菌SQR9生物膜形成和根际定殖分子机理研究[D];南京农业大学;2014年

10 何洪静;表皮葡萄球菌耐药特征及其PIA上游调控子与亚-MIC红霉素影响其生物膜形成的关系研究[D];第三军医大学;2015年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 闫颖娟;基于生物膜形成的乳酸菌连续接种工艺研究[D];南京农业大学;2010年

2 王薇;管道特征对实际供水管网生物膜微生物种群多样性的影响研究[D];浙江大学;2015年

3 杨安逸;沼气搅拌式固定床的工艺及其生物膜特性[D];黑龙江八一农垦大学;2015年

4 王娟;抗生素锁技术治疗中心静脉导管相关感染的实验室研究[D];长江大学;2015年

5 尼逸伦;池塘生物膜低碳养殖新模式应用研究[D];集美大学;2015年

6 尹正国;脱管散体外抗铜绿假单胞菌生物膜作用的研究[D];甘肃中医药大学(原名：甘肃中医学院);2015年

7 董丽红;棉花根系分泌物对枯草芽胞杆菌NCD-2菌株生物膜形成的影响[D];河北农业大学;2015年

8 谢冰涵;低温对MFC产电性能及阳极生物膜群落结构影响的研究[D];哈尔滨工业大学;2015年

9 翟振;LEA蛋白特征重复片段对POPE生物膜的干燥保护活性研究[D];上海理工大学;2015年

10 戴行楠;污垢对城市原生污水换热的影响[D];中国矿业大学;2015年

，

本文编号：841393