转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定

发布时间：2017-09-13 22:43

  本文关键词：转Bt-pta基因水稻后代分子检测与抗虫性鉴定

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【摘要】：水稻是世界上最重要粮食作物之一,世界上近半数人口以稻米为食。一直以来,虫害是危害水稻产量的重要因素之一,而利用转基因技术培育抗虫水稻,可以有效解决这个问题。本研究以优良水稻恢复系辐恢838为受体材料,采用农杆菌介导法,将重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转入其中,通过报告基因GUS表达检测,目的基因PCR检测,筛选出阳性T_0代转基因水稻;将其收获后种植,对其进行报告基因GUS表达检测,及目的基因PCR检测,检测出T_1代双价转基因水稻,对其进行抗虫性鉴定;将抗虫效果较好的双价转基因水稻收获后种下,得到T_2代转基因水稻,每个株系取10株,对目的基因进行PCR检测,获得纯合的双价抗虫转基因水稻。本论文获得的具体结果如下:1.构建双价植物表达载体:首先构建中间载体,用HindⅢ和SpeI分别对基础表达载体pCAMBIA1301和质粒pUC57-Bt进行双酶切,回收目的基因Bt和载体骨架pCAMBIA1301,然后通过T4 DNA连接酶将目的基因连接到载体骨架上,构建中间载体pCAMBIA1301-Bt;然后用HindⅢ分别酶切pCU57-pta与中间载体pCAMBIA1301-Bt,回收目的基因与中间载体骨架,再用T4 DNA连接酶将目的基因pta连接到中间载体骨架上,成功构建植物表达质粒pCAMBIA1301-Bt-pta。2.T_0代转基因水稻的获得及初步检测:用农杆菌介导法将双价植物表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta转化优良水稻恢复系辐恢838,经驯化后移栽共获得105株再生植株,经过GUS化学组织染色及PCR检测,最终得到3个T_0代转双价基因阳性转化子。3.T_1代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定:将分单株收获的T_0代转基因水稻种子种下,得到T_1代转基因水稻株系,检测其报告基因GUS表达水平,并对初步检测出的阳性植株进行目的基因PCR检测、Bt毒蛋白表达酶联免疫检测以及室内和室外的抗虫性检测,共检测出29株抗虫效果较好的双价转基因水稻,并对其农艺性状进行考察。4.T_2代纯合双价转基因水稻的获得:分单株收获T_1代29株抗虫效果较好的双价转基因水稻,种植获得29个株系,每个株系随机取10株,PCR法检测目的基因,10株全含目的基因的株系共29个,该29株系即为目的基因纯合株系,为以后组配杂交组合,获得抗虫杂交水稻提供恢复系材料。
【关键词】：水稻 Bt pta 抗虫 转基因
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.11
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 英文缩略词与英汉对照10-11
• 第一章 前言11-22
• 1 文献综述11-19
• 1.1 双价转基因水稻的研究进展11-16
• 1.1.1 Pta基因及转pta基因抗虫水稻的作用机理12-13
• 1.1.2 Bt基因及转Bt基因抗虫水稻的作用机理13-14
• 1.1.3 转基因抗虫水稻的安全性14-15
• 1.1.4 转基因水稻研究的展望15-16
• 1.2 转基因植株的检测16-19
• 2 本研究的目的、意义以及主要研究内容19-22
• 2.1 研究目的和意义19-20
• 2.2 研究的主要内容20-22
• 第二章 T_0代转基因水稻植株的转化及初步筛选22-32
• 1 材料22-23
• 1.1 供试水稻品种22
• 1.2 菌株和质粒22
• 1.3 主要试剂及引物22-23
• 1.3.1 主要试剂22-23
• 1.3.2 引物23
• 1.4 主要仪器23
• 1.5 主要溶液配方23
• 2 方法23-27
• 2.1 双价载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建23-24
• 2.2 农杆菌介导的水稻遗传转化24
• 2.3 转基因水稻再生植株炼苗及移栽24
• 2.4 转Bt-pta水稻再生植株检测24-27
• 2.4.1 GUS检测24-25
• 2.4.2 转Bt-pta水稻再生植株基因组DNA提取25
• 2.4.3 阳性对照质粒提取25-26
• 2.4.4 转Bt-pta基因再生植株的PCR检测26-27
• 2.4.5 DNA琼脂糖凝胶电泳27
• 3 结果与分析27-30
• 3.1 重组表达载体pCAMBIA1301-Bt-pta的构建27-28
• 3.2 再生植株的获得28
• 3.3 转Bt-pta基因水稻再生植株鉴定28-30
• 3.3.1 GUS组织化学染色分析28-29
• 3.3.2 转基因植株的PCR检测29-30
• 4 讨论30-32
• 4.1 关于双价转基因抗虫水稻的获得30-31
• 4.2 关于双价转基因抗虫水稻的抗虫性鉴定31-32
• 第三章 T_1代和T_2代转基因水稻的分子检测及抗虫性鉴定32-47
• 1 材料32-33
• 1.1 水稻材料32
• 1.2 质粒32
• 1.3 主要试剂及引物32
• 1.3.1 主要试剂32
• 1.3.2 引物32
• 1.4 主要仪器32-33
• 1.5 主要试剂配方33
• 1.6 供试昆虫33
• 2 方法33-38
• 2.1 T_1代转基因水稻的分子检测33-35
• 2.1.1 T_1代转基因水稻的GUS检测33
• 2.1.2 T_1代转基因水稻的PCR检测33-34
• 2.1.3 T_1代转基因水稻中Bt毒蛋白的含量与其抗虫性的关系34-35
• 2.2 T_1代转基因水稻抗虫性鉴定35-37
• 2.2.1 T_1代转基因水稻抗虫性室内鉴定35-36
• 2.2.2 T_1代转基因水稻抗虫性田间鉴定36-37
• 2.2.3 田间自然发虫的调查37
• 2.3 T_1代转基因水稻主要农艺性状的考察37
• 2.4 T_2代转基因水稻的分子检测37-38
• 3 结果与分析38-45
• 3.1 T_1转基因水稻的分子检测38-39
• 3.1.1 转基因水稻的GUS检测38
• 3.1.2 T_1代转基因水稻的PCR检测38-39
• 3.2 T_1代转基因水稻中Bt毒蛋白的含量与其抗虫性的关系39-41
• 3.2.1 T_1代转基因水稻Cry1C蛋白ELISA检测标准曲线绘制39-40
• 3.2.2 T_1代转基因水稻Cry1C蛋白ELISA检测40-41
• 3.3 T_1代转基因水稻的抗虫性鉴定41-44
• 3.3.1 T_1代转基因水稻的室内抗虫性鉴定41-42
• 3.3.2 T_1代转基因水稻的田间抗虫性鉴定42-44
• 3.3.3 T_1代转基因水稻的田间自然发虫调查44
• 3.4 T_1代转基因水稻的农艺性状的考察44-45
• 3.5 T_2代转基因水稻的分子检测45
• 4 讨论45-47
• 4.1 关于高抗性、稳定遗传的双价转基因水稻的获得45-46
• 4.2 关于双价转基因水稻农艺性状的改变46-47
• 第四章 结论与展望47-49
• 1 结论47
• 2 创新点47
• 3 展望47-49
• 致谢49-51
• 参考文献51-56
• 附录一56-57
• 附录二57-58

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本文编号：846362