布氏乳杆菌对断奶獭兔肠道菌群、TLR2和TLR4基因表达的影响

发布时间：2017-09-13 23:34

  本文关键词：布氏乳杆菌对断奶獭兔肠道菌群、TLR2和TLR4基因表达的影响

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【摘要】：随着獭兔生产朝着规模化、集约化发展,腹泻已成为獭兔最主要的疾病之一,给獭兔养殖带来巨大经济损失。腹泻导致獭兔肠道菌群紊乱,肠道失去物理和生物的重要免疫屏障,Toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)识别和清除微生物入侵的功能同时也遭到破坏,而益生菌作为生物制剂在防治獭兔腹泻方面有着巨大的潜力和天然的优势。因此,本研究就獭兔腹泻发生后盲肠菌群结构变化及断奶獭兔饲喂布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri,L.buchneri)后肠道菌群结构、TLR2和TLR4基因表达情况进行了研究,结果如下：1.应用PCR-DGGE和Quantitative PCR (qPCR)分析健康獭兔与腹泻獭兔盲肠菌群结构。结果显示,腹泻獭兔PCR-DGGE图谱与健康獭兔比较差异不显著(P0.05),但香农指数(H')、丰富度(Ea)、均匀度(S)腹泻獭兔均高于健康獭兔,聚类分析和主成分分析(Principal component analysis, PCA)能够将腹泻和健康獭兔区分为不同的簇。腹泻獭兔盲肠梭菌类群Ⅳ、梭菌类群XⅣa、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和普拉梭杆菌等有益微生物数量显著降低(P0.01),而埃希氏大肠杆菌数量却显著升高(P0.05),其他菌属差异不显著。表明,獭兔腹泻发生后盲肠有益微生物数量降低,部分有害微生物数量升高；腹泻与健康獭兔菌群结构差异不显著,腹泻獭兔盲肠菌群结构有复杂化的趋势。2.日粮中添加1.0×10~4CFU·g~(-1)和1.0×105CFU·g~(-1)L.buchneri对断奶獭兔肠道菌群结构、TLR2和TLR4基因表达的影响。60只断奶獭兔(对照组、低剂量组和高剂量组)饲喂4周后,低剂量组獭兔体重总增重和日增重明显高于对照组和高剂量组(P0.01),高剂量组与对照组比较差异不显著(P0.05)。分别采用PCR-DGGE和qPCR比较各组肠道菌群结构、qPCR分析肠道中TLRs表达情况、ELISA方法检测外周血中细胞因子含量。结果显示,獭兔肠道菌群丰富度从十二指肠到盲肠呈“V”字形变化趋势,空肠丰富度最低：L.buchneri添加组肠道菌群香农指数(H',十二指肠P0.01、空肠P0.01、盲肠P0.05)、丰富度(Ea,十二指肠P0.01、空肠P0.01、盲肠P0.05)、均匀度(S,十二指肠P0.01、空肠P0.01、盲肠P0.05)显著增加,而回肠中H、Ea、S只有低剂量组显著增加(P0.01),高剂量组差异不显著(P0.05)。低剂量组和高剂量组獭兔空肠总菌(P0.01)、厚壁菌门(P0.01)、拟杆菌门(P0.05)、肠杆菌科(P0.01)、梭菌类群Ⅳ(P0.05)和溶纤维丁酸弧菌(P0.01)数量显著增加：回肠总菌(P0.01)、厚壁菌门(P0.05)、拟杆菌门(P0.01)、梭菌类群Ⅳ(P0.01)、浴纤维丁酸弧菌(P0.05)和梭菌类群Ⅰ(P0.01)数量显著增加,而肠杆科科数量显著降低(P0.01)。此外,乳酸杆菌属(P0.05)、双歧杆菌属(P0.05)和产琥珀酸丝状杆菌(P0.05)数量仅在高剂量组显著增加,低剂量组则无变化；盲肠中,L.buchneri添加组仅有肠杆菌科数量均显著降低(P0.01),而高剂量组中乳酸杆菌属(P0.05)、溶纤维丁酸弧菌(P0.05)数量显著增加,其它检测菌属无变化。此外,进一步分析空肠、回肠和盲肠中E.coil,发现回肠和盲肠中布氏乳杆菌添加组E.coil数量显著降低(P0.05),空肠也有降低但差异不显著(P0.05)。由此可见,L.buchneri能够提高肠道微生物丰富度,增加肠道中多种有益微生物数量,抑制部分有害菌增殖。qPCR检测肠道TLRs基因表达,L.buchneri添加组与对照组比较,各肠段中TLRs基因表达量均出现降低。L.buchneri添加组,空肠和盲肠TLR2和TLR4基因表达显著降低(P0.01)；回肠TLR2和TLR4基因表达量,低剂量组均显著低于对照组(P0.01),而高剂量组只有TLR4基因出现降低(P0.05),TLR2基因表达差异不显著(P0.05),说明L.buchneri具有下调肠道TLR2和TLR4的能力。L.buchneri添加组外周血中TNF-α显著升高(P0.01),且高剂量组高于低剂量组(P0.05)。IL-4在低剂量组和高剂量组均出现降低(P0.05),且高剂量组低于低剂量组(P0.05)。IL-1, IL-6和INF-y高剂量组与对照组比较显著降低(P0.05),但低剂量组变化不显著(P0.05)。IL-10和IL-12也有一定的变化但差异不显著(P0.05)。结论：①獭兔腹泻发生后盲肠有益微生物数量减少,有害细菌数量增加：肠道菌群结构在一定程度上有复杂化的趋势：② L.buchneri能够增加肠道菌群丰富度,显著增加有益微生物数量,抑制部分有害细菌增殖；L.buchner能够提高肠道菌群B/F比例,适量添加L.buchneri有助于提高獭兔饲料利用率；.buchner能够下调肠道TLR2和TLR4基因表达,有助于提高肠道组织对正常菌群的耐受,适量提高外周血TNF-α含量。
【关键词】：獭兔 腹泻 肠道菌群 布氏乳杆菌 TLRs
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S829.1
【目录】：

• 符号说明4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 文献综述12-21
• 1.1 引言12
• 1.2 肠道菌群及其功能12-13
• 1.3 益生菌及其功能13-15
• 1.3.1 芽孢杆菌属(Bacillus)14
• 1.3.2 乳酸杆菌属(Lactobacillus)14
• 1.3.3 双歧杆菌属(Bifidobacterium)14-15
• 1.4 乳酸菌功能15-17
• 1.4.1 营养功能15
• 1.4.2 预防和治疗疾病15-16
• 1.4.3 提高动物免疫力16-17
• 1.4.4 调整肠道微生态平衡17
• 1.5 TLRs相关研究17-20
• 1.5.1 TLRs的发现17-18
• 1.5.2 TLRs蛋白结构18
• 1.5.3 TLR2和TLR4相应配体18-19
• 1.5.4 TLR2和TLR4的分布19
• 1.5.5 乳酸杆菌与TLR2和TLR4相关研究19-20
• 1.6 研究目的及意义20-21
• 2 材料及方法21-27
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 主要试剂及仪器21
• 2.1.2 菌株准备21-22
• 2.1.3 獭兔饲料制备22-23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 动物试验23
• 2.2.2 样品采集23
• 2.2.3 DNA和RNA提取23-24
• 2.2.4 PCR-DGGE分析肠道菌群多样性24
• 2.2.5 qPCR检测肠道菌群数量24-25
• 2.2.6 qPCR分析TLR2和TLR4基因25-26
• 2.2.7 外周血血清中细胞因子检测26
• 2.3 数据分析26-27
• 3 试验结果27-40
• 3.1 PCR-DGGE和qPCR分析健康与腹泻獭兔盲肠菌群27-32
• 3.1.1 PCR-DGGE结果28
• 3.1.2 qPCR结果28-32
• 3.2 L.buchneri对獭兔肠道菌群及TLRs表达的影响32-40
• 3.2.1 PCR-DGGE检测肠道菌群种类变化32-35
• 3.2.2 qPCR检测肠道菌群数量变化35-38
• 3.2.3 TLRs基因在肠道中表达情况38
• 3.2.4 ELISA检测细胞因子表达情况38-40
• 3.2.5 獭兔体重变化40
• 4 讨论40-46
• 4.1 PCR-DGGE和qPCR分析健康与腹泻獭兔盲肠菌群40-42
• 4.2 L.buchneri对獭兔肠道菌群及TLRs表达的影响42-46
• 5 结论46-47
• 参考文献47-58
• 致谢58-59
• 攻读学位期间发表的学术论文情况59

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本文编号：846557