兰州鲇生长性状相关基因的分离、序列特征及组织特异性表达分析

发布时间：2017-09-14 12:10

  本文关键词：兰州鲇生长性状相关基因的分离、序列特征及组织特异性表达分析

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【摘要】：动物体肌肉的生长发育受到许多生肌决定因子在时间和空间上的精准调控。其中MyoD(myogenic determination gene)、MyoG(myogenin)和MSTN(myostatin)基因是3个重要的生肌决定因子。本研究运用RT-PCR、TA克隆和核酸测序等技术对兰州鲇(Silurus lanzhouensis)的MyoD、MyoG、MSTN基因CDS区及MyoD、MyoG全基因进行克隆和生物信息学分析,同时懫用实时荧光定量法开展了以上三个基因在兰州鲇的8个不同组织、不同性别个体间的表达规律研究。主要研究结果如下:1.获得兰州鲇MyoD基因的完整CDS区序列长度为810 bp(GenBank登录号:KT277551)及MyoD基因全序列长度为1210 bp(GenBank登录号:KT339175),包括部分5'端63 bp的序列和3'端58 bp的序列;ORF区含有3个外显子和2个内含子,外显子长度分别为510 bp,80 bp,和220 bp,内含子长度分别为156 bp和123 bp,编码269个氨基酸残基组成的可溶酸性蛋白质;预测亚细胞定位MyoD主要分布于细胞核(56.5%),MyoD二聚体结构具有螺旋-环-螺旋(bHLH)的特征。基于12种鱼类MyoD基因CDS序列构建系统发育树及编码区同源性比较,获得与传统分类关系相一致的结果。组织特异性表达结果显示,MyoD基因在兰州鲇肌肉组织中的表达量极显著高于其它7种组织,主要在肌肉组织中发挥作用,且雄鱼肌肉组织的表达量显著高于雌鱼。2.克隆测序获得兰州鲇MyoG基因的CDS区全序列长度为762 bp(GenBank登录号:KT580948)及MyoG基因全序列长度为1223 bp(GenBank登录号:KU302770);ORF区含有3个外显子和2个内含子,外显子长度分别为539 bp、104 bp和119 bp,内含子长度分别为330 bp和131 bp。生物信息学分析结果与MyoD基因相似,编码253个氨基酸残基组成的可溶酸性蛋白质;预测亚细胞定位MyoG主要分布于细胞核(52.2%),MyoG二聚体具有MRFs家族的bHLH保守结构。基于12种鱼类MyoG基因CDS序列构建系统发育树及编码区同源性比较,获得与传统分类相一致的结果。组织特异性表达结果显示,MyoG基因在兰州鲇肌肉组织中的表达量极显著高于其它7种组织,主要在肌肉组织中发挥作用,且雄鱼肌肉组织的表达量显著高于雌鱼。3.克隆测序获得兰州鲇MSTN基因的CDS区全序列长度为1182 bp(GenBank登录号:KU302769),编码393个氨基酸残基组成的可溶酸性蛋白质;预测亚细胞定位MSTN蛋白,主要在细胞核外分布,MSTN二聚体结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成。基于12种不同动物的MSTN基因CDS序列构建系统发育树及编码区同源性比较,获得与传统分类相一致的结果。兰州鲇MSTN基因在肌肉组织中的表达量极显著高于其它7种组织,在脑组织中的表达量显著的高于除肌肉外的其它6种组织;此基因主要在肌肉组织中发挥作用,肌肉组织MSTN的表达雌鱼高于雄鱼,但未达到显著水平,其它7种组织组间差异均不显著。
【关键词】：兰州鲇 基因克隆 MyoD MyoG MSTN 生物信息学 荧光定量
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要4-6
• Summary6-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1. 兰州鲇概述11-12
• 2 鱼类分子育种技术研究进展12-13
• 2.1 分子标记辅助育种12-13
• 2.2 转基因育种13
• 3 本试验候选基因研究现状13-16
• 3.1 MyoD基因研究现状13-15
• 3.1.1 MRFs家族基因13-14
• 3.1.2 MyoD基因简介14-15
• 3.2 MyoG基因研究现状15
• 3.3 MSTN基因研究概述15-16
• 4 实时荧光定量PCR技术16-17
• 4.1 Real-time FQ-PCR简介16
• 4.2 Real-time FQ-PCR原理16-17
• 4.3 Real-time PCR定量分析方法17
• 5 本研究的目的及意义17-19
• 第二章 兰州鲇MyoD基因的分离、序列特征与表达分析19-37
• 1 引言19
• 2 试验材料19-21
• 2.1 试验动物19
• 2.2 主要试剂及材料19-20
• 2.3 溶液、试剂配制20-21
• 2.4 主要仪器设备21
• 3 试验方法21-27
• 3.1 MyoD基因克隆与生物信息学分析21-26
• 3.1.1 基因组DNA的提取与检测21-22
• 3.1.2 RNA的提取方法及检测22-23
• 3.1.3 cDNA第一条链合成23
• 3.1.4 MyoD基因引物的设计与合成23-24
• 3.1.5 普通PCR反应24
• 3.1.6 MyoD基因克隆与鉴定24-25
• 3.1.7 MyoD基因生物信息学分析25-26
• 3.2 MyoD基因实时荧光定量PCR26-27
• 3.2.1 实时定量PCR引物设计与合成26
• 3.2.2 普通PCR扩增与验证测序26
• 3.2.3 Real-time FQ-PCR26-27
• 3.2.4 数据统计处理27
• 4 结果与分析27-34
• 4.1 MyoD基因克隆与序列分析结果27-31
• 4.1.1 基因组DNA、RNA提取与检测结果27-28
• 4.1.2 MyoD基因PCR扩增与TA克隆结果28
• 4.1.3 兰州鲇MyoD核苷酸序列及编码氨基酸序列分析28-29
• 4.1.4 兰州鲇MyoD蛋白理化性质分析29-30
• 4.1.5 兰州鲇MyoD蛋白二级结构预测分析30
• 4.1.6 兰州鲇MyoD基因同源性及系统发育分析30-31
• 4.2 MyoD基因荧光定量结果31-34
• 4.2.1 兰州鲇八个组织总RNA提取结果31-32
• 4.2.2 MyoD普通PCR及验证测序结果32
• 4.2.3 Real-time FQ-PCR动力学曲线32
• 4.2.4 Real-time FQ-PCR融解曲线32-33
• 4.2.5 MyoD mRNA组织表达差异33-34
• 5 讨论34-37
• 5.1 MyoD基因序列分析34-36
• 5.2 MyoD基因组织表达分析36-37
• 第三章 兰州鲇MyoG基因的分离、序列特征与表达分析37-47
• 1 引言37
• 2 试验材料37
• 3 试验方法37-39
• 3.1 MyoG基因克隆与生物信息学分析37-38
• 3.1.1 基因组DNA的提取与检测37
• 3.1.2 总RNA的提取与检测37
• 3.1.3 cDNA第一条链的合成37
• 3.1.4 MyoG基因引物的设计与合成37-38
• 3.1.5 普通PCR反应38
• 3.1.6 MyoG基因克隆与鉴定38
• 3.1.7 MyoG基因生物信息学分析38
• 3.2 MyoG基因实时荧光定量PCR38-39
• 3.2.1 实时定量PCR引物设计与合成38
• 3.2.2 普通PCR及验证测序38
• 3.2.3 Real-time FQ-PCR38
• 3.2.4 数据处理与分析38-39
• 4 实验结果39-45
• 4.1 MyoG基因克隆与序列分析结果39-42
• 4.1.1 基因组DNA提取与检测结果39
• 4.1.2 MyoG基因PCR扩增与TA克隆结果39
• 4.1.3 兰州鲇MyoG核苷酸序列及编码氨基酸序列分析39-40
• 4.1.4 兰州鲇MyoG蛋白理化性质分析40-41
• 4.1.5 兰州鲇MyoG蛋白二级结构预测分析41
• 4.1.6 兰州鲇MyoG基因同源性及系统发育分析41-42
• 4.2 MyoG基因荧光定量结果42-45
• 4.2.1 兰州鲇八个组织总RNA提取检测结果42-43
• 4.2.2 MyoG普通PCR及验证测序结果43
• 4.2.3 Real-time FQ-PCR动力学曲线43
• 4.2.4 Real-time FQ-PCR融解曲线43-44
• 4.2.5 MyoG mRNA组织表达差异44-45
• 5 讨论45-47
• 5.1MyoG基因序列分析45-46
• 5.2 MyoG基因组织表达分析46-47
• 第四章 兰州鲇MSTN基因的分离、序列特征与表达分析47-59
• 1 引言47
• 2 试验材料47
• 3 试验方法47-49
• 3.1 MSTN基因克隆与生物信息学分析47-48
• 3.1.1 基因组DNA的提取与检测47
• 3.1.2 总RNA的提取与检测47
• 3.1.3 cDNA第一条链的合成47
• 3.1.4 MSTN基因引物的设计与合成47-48
• 3.1.5 普通PCR反应48
• 3.1.6 MSTN基因克隆与鉴定48
• 3.1.7 MSTN基因生物信息学分析48
• 3.2 MSTN基因实时荧光定量PCR48-49
• 3.2.1 实时定量PCR引物设计与合成48-49
• 3.2.2 普通PCR及验证测序49
• 3.2.3 Real-time FQ-PCR49
• 3.2.4 数据处理与分析49
• 4 实验结果49-56
• 4.1 MSTN基因克隆与序列分析结果49-54
• 4.1.1 基因组DNA提取与检测结果49
• 4.1.2 MSTN基因PCR扩增与TA克隆结果49-50
• 4.1.3 兰州鲇MSTN核苷酸序列及编码氨基酸序列分析50
• 4.1.4 兰州鲇MSTN蛋白理化性质分析50-51
• 4.1.5 兰州鲇MSTN蛋白二级结构预测分析51-53
• 4.1.6 兰州鲇MSTN基因同源性及系统发育分析53-54
• 4.2 MSTN基因荧光定量结果54-56
• 4.2.1 兰州鲇八个组织总RNA提取检测结果54
• 4.2.2 MSTN普通PCR及验证测序结果54
• 4.2.3 Real-time FQ-PCR动力学曲线54-55
• 4.2.4 Real-time FQ-PCR融解曲线55
• 4.2.5 MSTN mRNA组织表达差异55-56
• 5 讨论56-59
• 5.1 MSTN基因克隆与序列分析56-57
• 5.2 MSTN基因组织表达分析57-59
• 第五章 结论59-61
• 参考文献61-66
• 致谢66-67
• 作者简介67-68
• 导师简介68-69

【参考文献】

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本文编号：849936