ABA代谢关键基因调控桃休眠的分子机制研究

发布时间：2017-09-18 09:19

  本文关键词：ABA代谢关键基因调控桃休眠的分子机制研究

  更多相关文章： 休眠 芽 种子 CYP707A ABA

【摘要】：试验于2013-2015年在山东农业大学国家苹果工程中心、作物生物学国家重点实验室及山东省果树研究所(泰安)进行,以‘中油4号’(Prunus persica var.nectariana cv.Zhongyousiha)油桃为实验材料,通过同源比对的方式查找桃树基因组中调控ABA代谢的关键基因,利用realtime PCR技术检测ABA代谢关键基因在种子休眠以及芽休眠过程中的表达模式,然后比较异同。另外,我们还成功克隆了3个控制ABA分解的CYP707A基因家族成员,并成功诱导表达了其相应的蛋白,为以后进一步研究ABA8’-羟化酶的蛋白奠定了基础,同时获得桃CYP707A家族3个基因的过表达拟南芥植株。主要结果如下:(1)通过拟南芥中ABA代谢相关基因(ZEP,NCED,AAO,CYP707A,SDR1)的蛋白序列同源比对桃树基因组,根据保守性分析删除冗余序列,最终在桃树基因组中得到4个NCED家族基因类似成员、1个AAO基因家族成员、3个CYP707A家族基因成员,以及ZEP和SDR1的同源基因。(2)通过定量分析研究桃中ABA代谢相关基因在花芽以及叶芽休眠过程中的的表达模式,我们发现ABA代谢相关基因在叶芽和花芽休眠过程中具有相同的表达模式,其中,NCED家族基因在芽的休眠诱导以及深休眠阶段起到重要的调控作用,PpCYP707A2和PpCYP707A3在芽休眠解除阶段起到重要的调控作用。(3)利用荧光定量方法研究了桃中ABA代谢相关基因在种子休眠过程中的表达模式。结果显示,NCED家族成员在种子发育过程(种子休眠诱导)中表达水平逐渐升高,PpCYP707A2和PpCYP7073在种子休眠解除阶段表达量骤然升高,这与芽休眠的变化趋势是一致的,说明ABA控制芽休眠以及种子休眠存在着一定的共通性。(4)利用plantCARE在线启动子分析软件对桃中CYP707A家族3个基因的启动子进行分析,结果显示,这些基因的启动子都含有ABRE-motif和GARE-motif。利用GA3和ABA处理桃花芽后,只有PpCYP707A2能够被GA3和ABA所诱导。(5)构建正义植物表达载体PBI121-PpCYP707A1、PBI121-PpCYP707A2、PBI121-PpCYP707A3,采用农杆菌介导的方法,转化拟南芥,同时转空载体作为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株,PCR鉴定发现PpCYP707A1、PpCYP707A2、PpCYP707A3在拟南芥中得到成功表达。(6)构建原核表达载体PGST-PpCYP707A1、PGST-PpCYP707A2,并且将重组表达载体成功转化大肠杆菌BL21,成功诱导纯化了PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明,表达蛋白与预期蛋白大小一致。
【关键词】：休眠 芽 种子 CYP707A ABA
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S662.1
【目录】：

• 符号说明4-9
• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-27
• 1.1 芽休眠13-19
• 1.1.1 芽休眠的定义以及分类13-14
• 1.1.2 芽休眠进程的确定14
• 1.1.3 环境因子在芽休眠过程中的调节作用14-16
• 1.1.4 休眠分子机制的研究方法16
• 1.1.5 芽休眠过程中的分子机制16-18
• 1.1.6 植物激素与芽休眠18-19
• 1.2 种子休眠19-25
• 1.2.1 种子休眠的诱导20-23
• 1.2.2 种子休眠的解除23-25
• 1.3 ABA的代谢途径25
• 1.4 ABA8′-羟化酶在植物中的作用25-27
• 2 材料与方法27-43
• 2.1 实验材料与处理27-29
• 2.1.1 试验材料27
• 2.1.2 载体和菌株27
• 2.1.3 生化试剂27
• 2.1.4 仪器设备27-29
• 2.1.5 引物的合成及测序29
• 2.2 实验方法29-43
• 2.2.1 样品采集29
• 2.2.2 GA_3处理成熟桃种子29
• 2.2.3 桃种子冷藏处理29
• 2.2.4 桃种子萌芽率测试29-30
• 2.2.5 桃休眠进程的界定30
• 2.2.6 不同破眠剂处理休眠中的桃芽30
• 2.2.7 GA_3和ABA分别处理休眠中的桃芽30
• 2.2.8 鉴定桃中ABA代谢相关基因30-31
• 2.2.9 桃组织DNA的提取31
• 2.2.10 桃组织RNA的提取31-32
• 2.2.11 cDNA第一条链的获取32-33
• 2.2.12 荧光定量PCR33-34
• 2.2.13 高保真酶扩增目的基因34
• 2.2.14 PCR产物的回收34-35
• 2.2.15 TA克隆35
• 2.2.16 大肠杆菌感受态细胞的制备35-36
• 2.2.17 DH5α 感受态细胞的转化36
• 2.2.18 菌落PCR36-37
• 2.2.19 质粒提取37-38
• 2.2.20 植物表达载体的构建38
• 2.2.21 农杆菌LBA4404感受态细胞的制备38-39
• 2.2.22 冻融法转化LBA4404农杆菌感受态39
• 2.2.23 拟南芥转化39-40
• 2.2.24 融合蛋白的诱导表达40
• 2.2.25 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)40-41
• 2.2.26 ABA含量的测定41-43
• 3 结果与分析43-60
• 3.1 ABA代谢关键基因在桃芽休眠以及种子休眠过程中的表达模式分析43-54
• 3.1.1 桃基因组中ABA代谢相关基因的鉴定43-44
• 3.1.2 桃基因组中ABA代谢相关基因的进化树分析44-46
• 3.1.3 桃花芽和桃叶芽休眠状态的确定46-47
• 3.1.4 ABA代谢关键基因在桃花芽和叶芽休眠过程中的表达模式分析47-48
• 3.1.5 ABA代谢关键基因在种子发育过程中的表达模式分析48-50
• 3.1.6 ABA代谢关键基因在种子层积过程中的表达模式分析50-52
• 3.1.7 赤霉素对种子中ABA代谢关键基因的作用52-53
• 3.1.8 不同的破眠剂对深休眠期桃花芽的破眠影响53-54
• 3.2 CYP707A家族基因的克隆与功能验证54-60
• 3.2.1 PpCYP707As的基因克隆以及基因组结构分析54
• 3.2.2 PpCYP707As正义表达载体的构建54-55
• 3.2.3 PpCYP707As正义表达载体正义转化拟南芥55-56
• 3.2.4 CYP707A基因家族成员启动子克隆以及GUS染色56-57
• 3.2.5 PpCYP707As的组织特异性分析57
• 3.2.6 PpCYP707As在花芽休眠过程中的特异性分析57-58
• 3.2.7 不同处理对桃花芽中CYP707A基因家族成员的表达调控58-59
• 3.2.8 PpCYP707A1和PpCYP707A2蛋白原核表达59-60
• 4 讨论60-65
• 4.1 ABA代谢通路在调控叶芽和花芽中的作用60-61
• 4.2 ABA代谢关键基因的高水平表达与种子休眠的诱导有关61-63
• 4.3 种子休眠的解除与ABA代谢基因的关系63-64
• 4.4 芽休眠和种子休眠是不同的但存在一定共同的调控机制64-65
• 5 结论65-66
• 参考文献66-81
• 致谢81-82
• 攻读学位期间发表的学术论文82-83
• 附件83

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 谭钺;冷传远;李玲;徐臣善;陈修德;高东升;;高温和单氰胺对油桃休眠花芽呼吸代谢的影响[J];应用生态学报;2012年09期

2 李玲;谭钺;王慧;冷传远;李冬梅;陈修德;高东升;;桃花芽自然休眠期间水孔蛋白基因的转录表达[J];应用生态学报;2011年11期

3 李茜茜;汪晓峰;;ABA分解代谢及其代谢关键酶—8′-羟化酶[J];广西植物;2009年03期

4 段成国,李宪利,高东升,刘焕芳,李萌;内源ABA和GA_3对欧洲甜樱桃花芽自然休眠的调控[J];园艺学报;2004年02期

，

本文编号：874678