热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR，Tail

  本文关键词：转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析，由笔耕文化传播整理发布。

      在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成： ①由特异性引物和简并引物扩增出的产物； ②由同一特异性引物扩增出的产物； ③由同一简并引物扩增出的产物。

      种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

      第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。

      第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

      Tail-PCR的技术优点及技术难点。

      Tail-PCR技术的优点：

1）简单。只要设计好引物，即可以用基因组DNA作模板直接筛选到目标序列，节省了PCR反应前后的许多费时，费力的操作程序。

2）特异性高。用短的简并引物和长的特异性嵌套引物相组合，通过不对称的温度循环和分级反应，使反应体系有利于特异引物的扩增，最终的扩增产物中目的片段占绝对优势，反应产物可以直接用作探针标记和测序模板。

3）高效灵敏。使用任何一个简并引物，在60％-80％的反应中能够产生特异性产物。

4）快速。整个Tail-PCR反应循环能够在1天内完成，可以快速地获得目标片段。

5）不涉及连接反应，反应产物准确可靠，重复性好。

      但是，，Tail-PCR反应需要较多的引物组合，并且由于简并引物存在有限的结合位点，对于个别的侧翼序列，即使使用不同的简并引物也难以扩增到阳性结果。整个Tail-PCR需要一系列连续的反应，反应条件的设置要求比较精细。

[1] Liu Yao- Guang,Robert F Whitter. Thermal asymmetric interlaced PC R:automatable amplification and sequencing of insert end fragment from Pl and YAC clones for chromosome walking[ J] . Genomics,1995 ,25 :674一681

[2」Liu Yao- Guang，Huang Ning.Efficient amplification of insert end sequences from bacterial artificial chromosome clones by thermal asym-metric interlaced PC风J] Plant Molecular Biology Reporter,1998 ,16(2) :175一181

[3] 方进，瞿文学，王文明,等. 转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析[J]. 遗传学报，2001，2（4）：345－357

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