蓝色相关基因转化‘Robina’百合的研究

发布时间：2017-09-22 06:16

  本文关键词：蓝色相关基因转化‘Robina’百合的研究

  更多相关文章： Robina百合 胚性愈伤 小鳞片 农杆菌介导的转化 F3’5’H基因

【摘要】：花色是花卉最具视觉冲击力的审美特征,同时也是决定花卉的观赏价值的最重要因素之一。百合是单子叶植物纲百合科百合属多年生草本球根植物,是世界上著名的五大切花之一,在世界花卉交易中占有非常重要的市场份额。百合中由于缺乏F3’5’H基因而缺乏飞燕草素,所以自然界中没有紫色或蓝色的百合花。因此,创造蓝色百合成为很多育种家追求的目标。本研究以百合(Lilium spp.)OT(Oriental×Trumpet)系杂交品种‘Robina’悬浮细胞团和小鳞片作为转化受体材料,使用农杆菌介导法转化含有蝴蝶兰F3’5’H基因载体(p1300-pPZP-F3’5’H-DFR)。对其遗传转化体系进行了优化,得到了百合潮霉素抗性植株。对得到的植株进行PCR检测、RT-PCR检测、southern blot检测分析,表明载体导入到百合基因组中,并获得6个百合转基因株系。研究取得的主要结果如下:1.为了获得胚性愈伤组织,对不同大小的花苞的花丝、花柱和子房进行诱导,花苞大小为8~10cm时,胚性愈伤组织的诱导率最高,花丝为35.77%,子房为22.22%,花柱为18.13%。同时花苞大小为5~7 cm时,子房的不定芽产生率最高,为40.74%。诱导的胚性愈伤组织和不定芽为后面的转化提供了材料。2.对胚性愈伤组织进行了悬浮培养,成功得到胚性愈伤组织的悬浮培养系。分别进行了悬浮培养系的成苗试验和再生小鳞片的不定芽诱导试验,确定了最适合小鳞片诱导不定芽的NAA浓度为1.5 mg·L-1。对前期获得的百合转基因苗进行了移栽和驯化,经过培养成功获得高度为15~20cm的百合苗。3.为了优化遗传转化过程,分别对预培养时间,侵染的菌液浓度,共培养时间以及AS(乙酰丁香酮)浓度经行了评估。最终得到的胚性愈伤组织细胞团的最适条件是预培养2天,OD600为0.6,共培养3天,AS浓度为100μM时,稳定转化率最高为13.33%。小鳞片的最适条件是预培养3天,OD600为0.8,共培养3天,AS浓度为100μM时,稳定转化率最高为12.78%。4.分别对百合的悬浮细胞团和小鳞片进行了潮霉素抗性浓度做了评估。当潮霉素浓度为20mg·L-1时,小鳞片的分化率为1.67%,此时细胞团的分化率仅为0.67%,当潮霉素浓度为25mg·L-1时,无论小鳞片还是悬浮细胞团全部褐化死亡,确定两者最适的潮霉素浓度都为20mg·L-1。试验选用的抑菌素为羧苄青霉素,最终选用200mg·L-1的羧苄青霉素作为两者的抑菌浓度。5.对研究获得的187株潮霉素抗性植株中的80株进行PCR检测,得到15株PCR阳性植株,然后经过RT-PCR,并进行southern blot分析,其中有6个株系表现为阳性。
【关键词】：Robina百合 胚性愈伤 小鳞片 农杆菌介导的转化 F3’5’H基因
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S682.29
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-23
• 1.1 百合概述12
• 1.2 蓝色相关基因的研究进展12-17
• 1.2.1 蓝色花形成过程中的关键酶12-14
• 1.2.2 花青素的生物合成14-17
• 1.2.3 利用F3’5’H基因产生蓝色花17
• 1.3 百合转化受体系统的建立17-19
• 1.3.1 愈伤组织再生系统建立18
• 1.3.2 不定芽再生系统建立18-19
• 1.3.3 体细胞胚的再生系统建立19
• 1.4 百合农杆菌介导法的研究19-21
• 1.4.1 农杆菌介导法的介绍20
• 1.4.2 农杆菌介导法在百合研究中的应用20-21
• 1.5 本研究的目的和意义21-23
• 第二章 ‘Robina’百合遗传转化受体系的建立23-31
• 2.1 材料23
• 2.1.1 植物材料23
• 2.1.2 主要试剂23
• 2.2 试验方法23-24
• 2.2.1 胚性愈伤组织的诱导23
• 2.2.2 胚性愈伤组织的悬浮培养23
• 2.2.3 胚性愈伤组织的再生23-24
• 2.2.4 组培苗小鳞片诱导植株再生24
• 2.2.5 潮霉素浓度筛选和抑菌素浓度的确定24
• 2.2.6 移栽驯化培养24
• 2.2.7 数据统计与分析24
• 2.3 结果与分析24-29
• 2.3.1 百合花苞的大小对其胚性愈伤组织诱导的影响24-25
• 2.3.2 胚性愈伤组织的悬浮培养25-26
• 2.3.3 激素对组培苗小鳞片诱导植株再生的影响26
• 2.3.4 两种转化材料的获得26-27
• 2.3.5 潮霉素浓度筛选27-28
• 2.3.6 羧苄青霉素抑菌浓度的确定28
• 2.3.7 移栽驯化植株的成长变化28-29
• 2.4 讨论29
• 2.5 小结29-31
• 第三章 蝴蝶兰F3’5’H结合辅助基因转化‘Robina’百合的研究31-40
• 3.1 材料31
• 3.1.1 植物材料31
• 3.1.2 菌株和载体31
• 3.2 试剂和仪器31-32
• 3.2.1 主要试剂31-32
• 3.2.2 主要仪器32
• 3.3 方法32-33
• 3.3.1 农杆菌菌液制备32
• 3.3.2 转化受体的预培养32
• 3.3.3 侵染及共培养32
• 3.3.4 脱菌处理及筛选培养32-33
• 3.4 结果与分析33-35
• 3.4.1 预培养时间对转化效率的影响33
• 3.4.2 菌液浓度OD600对转化效率的影响33-34
• 3.4.3 共培养时间对转化效率的影响34
• 3.4.4 AS浓度对转化效率的影响34-35
• 3.5 转基因植株检测35-36
• 3.5.1 转化植株的PCR检测35
• 3.5.2 转基因植株的RT-PCR检测35-36
• 3.5.3 转基因植株的southern blot检测36
• 3.6 结果与分析36-38
• 3.6.1 转基因植株PCR检测结果36-37
• 3.6.2 转基因植株RT-PCR检测结果37
• 3.6.3 southern blot检测的结果37-38
• 3.7 讨论38-39
• 3.8 小结39-40
• 第四章 结论40-41
• 参考文献41-47
• 缩略词47-48
• 致谢48-49
• 作者简介49

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1 刘爱玲;蓝色相关基因转化‘Robina’百合的研究[D];西北农林科技大学;2016年

2 田菲菲;‘Robina’百合悬浮胚性愈伤组织遗传转化的研究[D];西北农林科技大学;2014年

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本文编号：899229