表达ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因鸡的研究

发布时间：2017-09-23 10:39

  本文关键词：表达ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因鸡的研究

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【摘要】：目的:ω-3脂肪酸脱氢酶(Fat-1基因)能够催化ω-6 PUFAs生成ω-3 PUFAs,后者中的EPA和DHA对胎儿的大脑和视神经发育起着至关重要的作用,同时在治疗老年痴呆症、心脑血管疾病、癌症以及精神疾病等方面有着一定的效果,而ω-6 PUFAs却与癌症的发生关联密切。人体内Fat-1基因的缺乏以及饮食中ω-3 PUFAs分布不均匀,导致体内ω-6 PUFAs严重堆积,使得ω-6/ω-3的比值远远超过1:1的理想状态,因此必须通过合理膳食来补充人体对ω-3 PUFAs的需求。植物中含有的α亚麻酸可以合成EPA和DHA,但合成效率极低,人类也可以通过摄食海产品来获得ω-3PUFAs,但这样一来成本过高,二来也容易在体内积累海洋污染物质。本研究的目的,就是通过对来源于秀丽线虫的Fat-1基因进行改造,使其能够在鸡体细胞内高效表达,同时有效地将ω-6转化为ω-3,优化ω-6/ω-3比例,在此基础上,利用转基因技术获得肉中富含ω-3 PUFAs的转基因鸡。方法:1.Fat-1基因密码子的优化、表达载体构建以及转基因活性分析胰酶消化法获得鸡胚胎成纤维细胞;根据鸡密码子使用频率,对秀丽隐杆线虫Fat-1基因序列进行优化合成;将改造后的Fat-1基因(c Fat-1)连接至p LL3.7表达载体,构建重组质粒p LL3.7-c Fat-1;经PCR、酶切、序列分析等手段对重组载体进行鉴定;利用Turbo Fect转染试剂将p LL3.7-c Fat-1转染体外培养的成纤维细胞;通过对被转染细胞中目的基因的RT-PCR检测和绿色荧光观察,分析c Fat-1基因在细胞中的表达;然后以气相色谱分析转染后细胞中的脂肪酸成分和含量。2.转基因鸡的生成(1)胚盘下腔显微注射法:于新鲜未孵化种蛋的赤道最高处开口,暴露胚盘,胚盘中央明区注射2μL重组质粒,保鲜膜封口,常规条件孵化;(2)外周血管显微注射法:将孵化至13~15期的鸡胚移入新的备用蛋壳,胚胎血管中注射外源质粒,保鲜膜封口后小角度翻蛋孵化。收集不同孵化时期的胚胎,提取组织DNA、RNA以及脂肪酸,随后进行冰冻切片检测;再对阳性个体的组织进行PCR、RT-PCR以及气相色谱检测分析。结果:重组载体经序列比对,发现优化后序列编码氨基酸与Fat-1基因一致;c Fat-1基因在鸡成纤维细胞中高效表达,成功构建了可在鸡体内表达c Fat-1基因的特异性表达载体;转基因细胞系中ω-3 PUFAs的含量从2.33522增升至5.21512,而ω-6 PUFAs减低了1.3倍左右,ω-6PUFAs/ω-3PUFAs比例从4.7降低到1.7;血管注射法获得的转基因鸡的肝脏、胸肌、腿肌等组织的冰冻切片中检测到荧光信号,PCR、RT-PCR结果也证实了外源基因的表达;肌肉脂肪酸分析发现,转基因阳性个体胸肌组织中ω-3 PUFAs的含量明显升高,且ω-6 PUFAs与ω-3 PUFAs之比从对照组的5.1下降至2.2。结论:本研究成功构建了适合在鸡体内表达的真核表达载体p LL3.7-c Fat-1;转染p LL3.7-c Fat-1的鸡成纤维细胞能高效表达外源基因,并能有效地将ω-6 PUFAs转化为ω-3 PUFAs;再以显微注射法产生转基因阳性个体,色谱分析结果证明转基因个体能够表达ω-3脂肪酸脱氢酶,胸肌中ω-6/ω-3的比值显著下降。
【关键词】：鸡 ω-3脂肪酸脱氢酶 基因表达 转基因
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 英文缩略表12-14
• 引言14-15
• 第一章 文献综述15-23
• 1.1 ω-3 多不饱和脂肪酸15-17
• 1.1.1 ω-3 多不饱和脂肪酸概况15-16
• 1.1.2 ω-3 多不饱和脂肪酸的作用16-17
• 1.1.2.1 ω-3 PUFAs参与脂质代谢16
• 1.1.2.2 ω-3 PUFAs参与基因调控16
• 1.1.2.3 ω-3 PUFAs调节细胞生长16
• 1.1.2.4 ω-3 PUFAs参与免疫调节16-17
• 1.1.2.5 ω-3 PUFAs的抗疾病作用17
• 1.2 ω-6 /ω-3 PUFAs的平衡17-18
• 1.3 脂肪酸脱氢酶Fat-1 基因的重要性18-19
• 1.3.1 Fat-1 基因及其作用机制18
• 1.3.2 Fat-1 转基因动物的研究18-19
• 1.4 转基因技术在品种培育中的应用19-22
• 1.4.1 转基因动物的产生19-20
• 1.4.2 转基因方法20-21
• 1.4.3 转基因技术应用21-22
• 1.5 本课题研究的目的和意义22-23
• 第二章 鸡胚胎成纤维细胞的体外培养23-30
• 2.1 试验材料23-24
• 2.1.1 试验细胞23
• 2.1.2 主要试剂和仪器设备23-24
• 2.1.2.1 主要试剂23
• 2.1.2.2 主要试剂的配制23
• 2.1.2.3 主要仪器设备23-24
• 2.2 试验方法24-25
• 2.2.1 鸡胚胎成纤维细胞的原代培养24
• 2.2.2 细胞的分离及传代24
• 2.2.3 细胞的冻存24-25
• 2.2.4 细胞的复苏25
• 2.3 结果与分析25-28
• 2.3.1 原代细胞的生长状况及形态特征25-26
• 2.3.2 传代细胞的生长情况及形态特征26-27
• 2.3.3 复苏细胞的生长状况及形态特征27-28
• 2.4 讨论28-29
• 2.5 结论29-30
• 第三章 Fat-1 基因密码子优化及高效表达载体的构建30-41
• 3.1 试验材料30-31
• 3.1.1 宿主菌和载体30
• 3.1.2 主要试剂30
• 3.1.3 常用试剂配置30-31
• 3.1.4 主要试验仪器31
• 3.2 试验方法31-34
• 3.2.1 Fat-1 基因的优化与人工合成31-32
• 3.2.2 cFat-1 基因的体外扩增和序列分析32-34
• 3.2.3 重组表达载体的构建与鉴定34
• 3.3 结果与分析34-39
• 3.3.1 Fat-1 的优化34-35
• 3.3.2 c Fat-1 基因的获得35-36
• 3.3.3 重组质粒的构建36-37
• 3.3.4 重组表达载体的鉴定37-39
• 3.4 讨论39-40
• 3.5 结论40-41
• 第四章c Fat-1 基因在鸡成纤维细胞中的表达41-53
• 4.1 试验材料41-42
• 4.1.1 试验样品41
• 4.1.2 主要试剂41
• 4.1.3 试剂配制41
• 4.1.4 主要仪器设备41-42
• 4.2 试验方法42-46
• 4.2.1 重组载体质粒的大量提取42-43
• 4.2.2 试验细胞的准备43
• 4.2.3 细胞转染43
• 4.2.4 阳性克隆的分子鉴定43-45
• 4.2.5 细胞脂肪酸测定45-46
• 4.3 结果分析46-50
• 4.3.1 pLL3.7-cFat-1 在鸡胚胎成纤维细胞中的表达46-47
• 4.3.2 转染细胞外源基因表达的分子鉴定47-48
• 4.3.3 转染细胞的分子水平鉴定48-50
• 4.4 讨论50-52
• 4.5 结论52-53
• 第五章 表达Fat-1 基因的转基因鸡的生成53-70
• 5.1 试验材料53-54
• 5.1.1 试验用种蛋53
• 5.1.2 主要试剂及耗材53
• 5.1.3 试剂配制53-54
• 5.1.4 仪器设备54
• 5.2 试验方法54-59
• 5.2.1 注射针的制备54
• 5.2.2 蛋壳膜及代用蛋壳的的制备54-55
• 5.2.3 待用种蛋的预处理55
• 5.2.4 重组载体的显微注射55-56
• 5.2.5 注射个体冰冻切片检测56
• 5.2.6 注射个体各组织PCR检测56-57
• 5.2.7 注射个体各组织RT-PCR鉴定57-58
• 5.2.8 注射个体的脂肪酸测定58-59
• 5.3 结果与分析59-67
• 5.3.1 胚胎孵化情况统计59-60
• 5.3.2 两种注射方法的比较60-62
• 5.3.3 重组载体显微注射后不同组织荧光检测62-63
• 5.3.4 转基因个体的组织PCR检测63-64
• 5.3.5 转基因个体的RT-PCR检测64-65
• 5.3.6 转基因个体脂肪酸测定结果65-67
• 5.4 讨论67-69
• 5.5 结论69-70
• 第六章 结论与创新70-71
• 6.1 全文结论70
• 6.2 论文的创新70-71
• 参考文献71-78
• 致谢78-79
• 作者简介79-80
• 导师评阅表80

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本文编号：904804