马尾松GRAS家族SHR和SCR同源基因的克隆与功能初步分析

发布时间：2017-09-25 16:02

  本文关键词：马尾松GRAS家族SHR和SCR同源基因的克隆与功能初步分析

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【摘要】：马尾松是我国重要的乡土树种,分布地域广,生长迅速且材性优良,但马尾松无性繁殖过程中生根困难,阻碍了遗传改良中最大遗传增益的获得。本论文研究了马尾松根发育相关的SHORT-ROOT(SHR)基因、SCARECROW(SCR)和SCARECROW-like1(SCL1)基因,结果如下:1)GRAS基因家族的SHR、SCR和SCL1及其同源基因是调控植物根和叶发育过程的基因。本研究利用同源克隆技术和末端快速扩增技术(RACE)获得马尾松的SHR、SCR和SCL1同源基因,并命名为PmSHR、PmSCR和PmSCL1,其完整cDNA序列长度分别为:2399bp、2827bp、3289bp;利用在线软件ORFFinder预测得PmSHR、PmSCR和PmSCL1的编码区长度分别为1509bp、2529bp、2415bp;分别编码502aa,842aa和804aa的氨基酸序列。利用在线软件ProtParam分析三个马尾松GRAS蛋白的理化性质,PmSHR分子式为C2533H3889N699O770S28,分子量约为57351.6Da;PmSCR的为C4038H6336N1182O1280S31,分子量约为92915.7Da;PmSCL1蛋白质分子式为C3958H6200N1110O1237S27,分子量约为89993.0Da;且PmSHR、PmSCR和PmSCL1蛋白都为不稳定的亲水蛋白。通过对PmSHR和PmSCR及PmSCL1编码的氨基酸序列分析,PmSHR属于SHR亚家族,PmSCR属于SCR亚家族,PmSCL1属于LISCL亚家族。2)组织特异性分析发现,50d龄的马尾松幼苗中PmSHR在根部表达量最高,是子叶约1.85倍,子叶表达量次之,下胚轴与上胚轴中PmSHR表达量分别为子叶中表达量的约0.78、0.61倍;PmSCR在根中表达量最高,是子叶中表达量的约1.25倍,下胚轴与上胚轴中PmSCR表达量均低于子叶,分别子叶中表达量的约0.63、0.5倍;PmSCL1在子叶中表达量最高,根中表达量稍低约为子叶的0.91倍,下胚轴与上胚轴中PmSCL1表达量均低于根部,分别为子叶中表达量的约0.61、0.53倍。3)利用酶切法构建了PmSHR、PmSCR和PmSCL1的绿色荧光蛋白融合表达载体。利用基因枪法将三种融合表达载体导入洋葱表皮细胞研究PmSHR、PmSCR和PmSCL1的亚细胞定位,荧光镜检结果发现PmSHR是细胞质蛋白,PmSCR和PmSCL1是核定位蛋白。4)在农杆菌介导下将PmSCR-GFP融合表达载体转化烟草,并通过基因组PCR和组织GFP荧光检测的方法鉴定转化型烟草。表型观察发现超表达PmSCR的转基因烟草根部较野生型明显发达,离体顶芽水培观察表明转基因烟草比野生型烟草不定根发生数更多。
【关键词】：马尾松 SHR SCR SCR-like 亚细胞定位 遗传转化
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S791.248
【目录】：

• 致谢3-4
• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 缩写词表6-9
• 第一章 文献综述9-21
• 1.1 马尾松概况9-11
• 1.1.1 马尾松分布、形态特征与价值9-10
• 1.1.2 马尾松功能基因研究10-11
• 1.2 GRAS转录因子家族的研究11-19
• 1.2.1 GARS转录因子蛋白结构11-12
• 1.2.2 GARS蛋白的生物学功能12-15
• 1.2.3 SHR和SCR在根部细胞间的移动与定位机制15-17
• 1.2.4 SHR和SCR在胚胎发育时期的表达17
• 1.2.5 GRAS基因在松科植物中的研究17-18
• 1.2.6 SHR和SCR基因在不同植物中克隆现状18-19
• 1.3 研究的目的和意义19-21
• 第二章 PmSHR、PmSCR及PmSCR-like1基因的克隆21-51
• 2.1 试验材料21
• 2.1.1 植物材料21
• 2.1.2 菌种及载体21
• 2.1.3 试剂及培养基21
• 2.1.4 引物合成与测序21
• 2.2 试验方法21-29
• 2.2.1 马尾松总RNA的提取及检测21-22
• 2.2.2 cDNA第一链合成22-23
• 2.2.3 中间片段扩增与测序23-24
• 2.2.4 cDNA末端快速扩增（RACE）24-27
• 2.2.5 PmSHR、PmSCR、PmSCL1基因完整ORF的克隆27-28
• 2.2.6 PmSHR、PmSCR、PmSCL1基因的生物信息学分析28
• 2.2.7 组织特异性表达分析28-29
• 2.3 结果与分析29-48
• 2.3.1 马尾松幼苗总RNA的提取29-30
• 2.3.2 马尾松PmSHR、PmSCR、PmSCL1基因全长与生物信息学分析30-47
• 2.3.3 组织特异性表达分析47-48
• 2.4 讨论48-51
• 第三章 PmSHR、PmSCR、PmSCL1基因真核表达初步分析51-67
• 3.1 试验材料51
• 3.1.1 植物材料51
• 3.1.2 菌种及质粒51
• 3.1.3 试剂及培养基51
• 3.2 试验方法51-58
• 3.2.1 绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体的构建51-54
• 3.2.2 融合表达载体转化农杆菌54-55
• 3.2.3 融合蛋白亚细胞定位55-56
• 3.2.4 农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化56-57
• 3.2.5 转化苗的鉴定57-58
• 3.2.6 转化的形态学观察58
• 3.3 结果与分析58-66
• 3.3.1 绿色荧光蛋白表达载体的构建与转化农杆菌检测58-60
• 3.3.2 融合蛋白的亚细胞定位60-62
• 3.3.3 烟草转化苗的鉴定62-63
• 3.3.4 转基因烟草表型观察63-66
• 3.4 讨论66-67
• 第四章 结论与展望67-69
• 4.1 结论67
• 4.2 展望67-69
• 附录69-74
• 参考文献74-80

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