浑浊红球菌脂质积累机制的碳代谢流分析及关键基因改造

发布时间：2017-09-25 18:03

  本文关键词：浑浊红球菌脂质积累机制的碳代谢流分析及关键基因改造

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【摘要】：产油微生物能够在细胞内积累大量甘油三酯,是传统动植物油脂的重要替代资源。同时,来自微生物发酵生产的脂肪酸还是交通燃料和合成化工产品的重要前体,因此十分有必要研究和开发一些能够高产脂的微生物菌株。产油细菌浑浊红球菌PD630(Rhodococcus opacus PD630)具有产脂量高、高细胞密度培养、利用多种碳源、基因组信息已经公布、而且建立了一套完善的遗传改造体系等特点,是工业化生产微生物油脂最具潜力的菌株之一。然而,浑浊红球菌PD630脂质积累机制还没有系统地分析和研究,本文通过基于GC-MS的13C代谢流分析(13C Metabolic flux analysis,13C-MFA)方法系统研究了高氮(HN)和低氮(LN)两种不同产脂培养条件下浑浊红球菌PD630脂质代谢调控上的差异;结合转录和酶活性分析找出了影响浑浊红球菌PD630脂质积累的关键调控基因;通过基因工程过表达这些关键基因,有效提高其脂质含量。本论文的主要研究内容和实验结果如下:首先,通过对浑浊红球菌PD630在HN(C/N,10:1)和LN(C/N,100:1)两种培养条件下生长和脂质差异的分析,发现氮源浓度对细胞内脂质和蛋白质含量有较大的影响。浑浊红球菌PD630在培养44 h后达到代谢稳定期。此时比生长速率最大,LN培养条件下的脂肪酸含量高达34.68%,HN培养条件下的脂肪酸含量却只有18.99%,而蛋白质的含量却从30.52%降到17.39%。然后,采用13C标记的代谢流分析方法对浑浊红球菌PD630在两种培养条件下脂质合成过程代谢反应网络中代谢流量的分布进行了研究。实验结果表明,两种培养条件下浑浊红球菌PD630细胞内不同的代谢流量分配比造成了其脂质积累的差别。两种培养条件下经过磷酸戊糖(PP)路径和Entner-Doudoroff(ED)路径这两条代谢途径总的代谢流量分布均超过90%,该结果表明在产油细菌浑浊红球菌PD630中PP和ED路径是其糖代谢的主要途径。然而,与HN培养条件相比,LN条件培养浑浊红球菌PD630时,流经PP路径的碳流量是HN培养条件下的5倍,而流经ED路径的碳流量只有HN培养条件下一半。这些结果与LN培养条件下6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)转录水平上调及酶活性的增加相对应。然而在LN培养条件下经苹果酸酶(ME)催化苹果酸(Mal)向丙酮酸(Pyr)(Mal+NADP+?Pyr+CO2+NADPH)转化的量是HN培养条件下的一半。这些结果表明,在浑浊红球菌PD630中PP路径中的6PGDH是提供脂质生物合成所需还原力NADPH的关键酶,而不是ME。最后,将来自PP路径中编码6PGDH的五个同源基因gnd分别在产油细菌浑浊红球菌PD630中过表达。在浑浊红球菌PD630过表达菌株中,6PGDH的酶活力及相应的转录水平显著提高。与对照菌株相比较,过表达重组菌株的总脂肪酸含量提高了20~28%。实验结果表明,来自PP路径的6PGDH在浑浊红球菌PD630脂肪酸合成过程中起到重要的调控作用,是其脂肪酸合成所需还原力NADPH的主要提供者。
【关键词】：浑浊红球菌PD630 代谢流分析 磷酸戊糖路径 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 NADPH
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93;TQ641
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩写符号对照表6-9
• 1 绪论9-18
• 1.1 产油微生物的研究进展9-11
• 1.1.1 概述9
• 1.1.2 微生物油脂在生物柴油中的应用进展9-10
• 1.1.3 微生物油脂在食品中的应用进展10-11
• 1.2 产油微生物及其脂质积累机制11-13
• 1.2.1 产油微生物脂肪酸合成代谢调控11
• 1.2.2 脂肪酸合成还原力NADPH的来源11-12
• 1.2.3 脂肪酸合成底物的供应12-13
• 1.3 浑浊红球菌PD630简介及其脂质积累研究现状13-15
• 1.3.1 浑浊红球菌简介13
• 1.3.2 浑浊红球菌PD630研究概况13-15
• 1.4 代谢流量分析15-16
• 1.4.1 计量学代谢流量分析方法15-16
• 1.4.2 基于同位素标记实验的代谢流量分析方法16
• 1.5 课题立题意义及主要研究内容16-18
• 2 材料与方法18-34
• 2.1 实验材料18-21
• 2.1.1 实验主要仪器与设备18
• 2.1.2 实验主要试剂18
• 2.1.3 培养基及其配方18-19
• 2.1.4 主要试剂的配制19
• 2.1.5 实验所用菌株和质粒19-20
• 2.1.6 引物的合成和测序20-21
• 2.2 ~（13）C标记的代谢流分析方法21-28
• 2.2.1 细胞培养21
• 2.2.2 发酵上清液组分分析21-22
• 2.2.3 R. opacus PD630生物质的测定22-23
• 2.2.4 蛋白质水解、衍生及GC-MS分析23
• 2.2.5 R. opacus PD630代谢网络的构建23-25
• 2.2.6 R. opacus PD630代谢流量配比的计算分析25-28
• 2.3 分子克隆的实验方法28-33
• 2.3.1 引物设计和目的基因片段的扩增28-29
• 2.3.2 重组质粒的构建29-31
• 2.3.3 过表达菌株的构建31
• 2.3.4 R. opacus PD630重组菌株的培养31
• 2.3.5 转录水平的检测31-33
• 2.3.6 6PGDH酶活性水平的检测33
• 2.4 统计数据分析33-34
• 3 结果与讨论34-48
• 3.1 ~（13）C标记的代谢流分析34-40
• 3.1.1 HN和LN培养条件下R. opacus PD630的生长和细胞组成34-38
• 3.1.2 R. opacus PD630细胞内~（13）C标记的代谢流分析结果38-40
• 3.2 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶对R. opacus PD630脂质积累的影响40-48
• 3.2.1 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因的克隆40-41
• 3.2.2 gnd过表达重组载体的构建41-42
• 3.2.3 R. opacus PD630过表达重组菌株的构建42
• 3.2.4 R. opacus PD630过表达重组菌株生长和脂质积累的分析42-45
• 3.2.5 R. opacus PD630过表达重组菌株 6PGDH酶活性分析45-46
• 3.2.6 R. opacus PD630过表达重组菌株相关基因转录水平的分析46-48
• 主要结论与展望48-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-58
• 附录I：R. opacus PD630的代谢化学计量平衡式58-61
• 附录II：作者在攻读硕士学位期间发表的论文61

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本文编号：918771