中国大鲵FoxA2、FoxC2和FoxL2基因cDNA序列的克隆及组织表达分析

发布时间：2017-09-26 00:25

  本文关键词：中国大鲵FoxA2、FoxC2和FoxL2基因cDNA序列的克隆及组织表达分析

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【摘要】：Fox(winged helix/forkhead)基因家族广泛存在于真核生物中,其FH结构域在进化中高度保守,根据相似性将其成员划分为FoxA-FoxS19个亚族。FH结构保守却功能多样,翻译后修饰可以使得Fox转录因子家族形成目标子集来特异性应答环境中的信号。Fox家族多个成员与人类疾病紧密相关,成为目前研究的热点。FoxA2基因是调节肝脏、胰腺等器官的发育及机体多条代谢途径的关键基因之一,被认为是遗传控制的一个开关。FoxC2基因是一类调控血管和淋巴管等脉管系统生长、发育的重要转录因子。近年来也发现其与多种癌症相关,参与肿瘤细胞侵袭和转移,是遗传疾病淋巴水肿-重睫综合症(lymphedema-distichiasis syndrome,LD)的致病基因。FoxL2基因是早期卵巢标志物之一,FoxL2作为雌性个体性别表型相关的体细胞标记基因,通过参与调控卵巢颗粒细胞增殖与分化,在卵泡的正常发育及卵巢功能的维持中发挥作用,是小睑裂综合症(blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome,BPES)的致病基因。本研究采用普通聚合酶链式反应(PCR)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得中国大鲵FoxC2和FoxL2基因的全长序列,以及FoxA2基因的cDNA全长序列,并对其进行序列分析,利用实时荧光定量PCR技术对中国大鲵各组织中它们的表达情况进行分析。得到如下结果：1.FoxA2基因的cDNA序列全长为1574bp,编码429个氨基酸,NCBI接收号为KU974963,FH区包含91个氨基酸,该基因相似性分析显示其核苷酸和氨基酸序列与两栖类具有很高的相似性,与哺乳类相似性较低。系统进化树分析显示中国大鲵与两栖类非洲爪蟾、热带爪蟾聚为单群,分布在外围,与鱼类单群相邻,体现出其水陆过渡的独特进化地位。2.FoxC2基因的cDNA序列全长为1841bp,共编码474个氨基酸,NCBI接收号为KU315724,FH区包含91个氨基酸,该基因相似性分析显示其核苷酸和氨基酸序列与两栖类相似性较高,与鱼类和哺乳类相似性较低。系统进化树分析显示鱼类斑点雀鳝分布于两栖类大群中,大鲵分布在该群的外围,体现出大鲵与鱼类FoxC2蛋白进化关系更加密切。3.FoxL2基因的cDNA序列全长为1296bp,共编码300个氨基酸,NCBI接收号为KU310892,FH区包含91个氨基酸,是其主要的DNA序列结合区,该基因相似性分析显示其核苷酸和氨基酸序列与两栖类具有很高的相似性,C末端作为转录激活区,也具有较高的保守性。翻译后修饰分析显示FoxL2含有较多磷酸化位点,推测其在体内的活性可能是通过磷酸化调控的。系统进化树分析显示中国大鲵从两栖类与硬骨鱼类的大群中单独分出,体现出其古老的进化地位。4.利用荧光定量PCR方法分析中国大鲵FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的组织表达情况,结果显示：FoxA2基因在肺中表达量最高,肝脏、肠道和卵巢中表达较低,精巢、脾脏、肌肉和肾脏中不表达。FoxC2基因在心脏和肾脏中表达量最高,精巢和肌肉中次之,肺和卵巢中较低,肝脏、脾脏和肠道中不表达。FoxL2基因在卵巢表达量最高,肾脏表达量次之,肌肉、精巢和肺中的表达量较低,肝脏、脾脏和肠道不表达。
【关键词】：中国大鲵 FoxA2 FoxC2 FoxL2 基因克隆 组织表达分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 文献综述10-20
• 1.1 Fox转录因子家族10-13
• 1.1.1 Fox家族的由来与命名10
• 1.1.2 Fox家族的调节机制10-12
• 1.1.3 Fox基因家族的功能12-13
• 1.2 FoxA2、FoxC2和FoxL2的研究进展13-18
• 1.2.1 FoxA2概述13-15
• 1.2.2 FoxC2概述15-16
• 1.2.3 FoxL2概述16-18
• 1.3 本研究的目的及意义18-20
• 2 材料和方法20-33
• 2.1 实验动物20
• 2.2 试剂及主要试剂的配制20-21
• 2.2.1 本研究所用的试剂及菌种20-21
• 2.2.2 主要试剂的配制21
• 2.3 实验仪器设备21-22
• 2.4 模板制备22-25
• 2.4.1 各组织总RNA的提取22
• 2.4.2 cDNA第一链的合成22-23
• 2.4.3 RACE模板的制备23-25
• 2.5 引物设计25-26
• 2.6 FoxC2、FoxL2基因全长序列及FoxA2基因中间片段获得26-28
• 2.6.1 PCR扩增26-27
• 2.6.2 PCR产物的回收27
• 2.6.3 连接27-28
• 2.6.4 转化28
• 2.6.5 菌落PCR鉴定28
• 2.7 FoxA2 cDNA末端序列快速扩增28-29
• 2.7.1 3'-RACE扩增28-29
• 2.7.2 5'-RACE扩增29
• 2.8 序列分析29-30
• 2.9 荧光定量PCR检测中国大鲵FoxA2、FoxC2和FoxL2基因在各组织中的表达30-33
• 2.9.1 荧光定量PCR引物设计30-31
• 2.9.2 最适退火温度的选择31
• 2.9.3 标准曲线的制作31-32
• 2.9.4 各组织中FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的表达检测32
• 2.9.5 数据分析32-33
• 3 结果与分析33-53
• 3.1 DNA与RNA提取结果33
• 3.2 PCR扩增结果33-35
• 3.2.1 FoxC2、FoxL2基因全长及FoxA2中间片段33-34
• 3.2.2 FoxA2 RACE扩增34-35
• 3.3 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因核苷酸序列分析35-38
• 3.4 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白质序列分析38-49
• 3.4.1 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白质序列基本性质38-40
• 3.4.2 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因序列相似性分析40-42
• 3.4.3 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白质序列比对42-46
• 3.4.4 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因蛋白质序列系统进化树构建46-48
• 3.4.5 Fox基因家族进化48-49
• 3.5 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因在大鲵各组织的表达49-53
• 3.5.1 实时荧光定量PCR标准曲线49-50
• 3.5.2 中国大鲵FoxA2、FoxC2和FoxL2基因各组织的差异表达50-53
• 4 讨论53-57
• 4.1 FoxA2基因的序列分析53
• 4.2 FoxC2基因的序列分析53-54
• 4.3 FoxL2基因的序列分析54-55
• 4.4 Fox基因家族进化分析55
• 4.5 FoxA2、FoxC2和FoxL2基因的组织表达分析55-57
• 5 结论57-58
• 参考文献58-63
• 致谢63-64
• 在学期间发表文章64

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本文编号：920452