成年小鼠不同生殖时期子宫颈组织中脂滴和自噬体PPAR、LC3和Atg5基因表达特点及其分布规律的研究
本文关键词：成年小鼠不同生殖时期子宫颈组织中脂滴和自噬体PPAR、LC3和Atg5基因表达特点及其分布规律的研究
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【摘要】：脂类是生命中必不可少的营养成分,在不同条件下细胞内脂类的代谢状况影响着组织器官的生理功能。脂类的合成、修饰与分解受到多种因素的影响,例如能量供应变化、细胞膜完整性、信号分子的转导、激素及细胞因子的调控以及外界环境的改变等。由于脂质代谢中多余的脂肪酸(FAs)对细胞是有害的,脂质的相对稳定性对细胞生存至关重要。为了预防脂类中毒,细胞会将多余的脂肪酸转移到中性脂质中,储存在被叫做脂滴(LD)的细胞器中。这种细胞器不仅是脂质和能量的存储库,而且还参与蛋白质信号传导与转运、某些激素的合成、膜的生物合成和胆固醇的稳定性等。近年来,脂滴生物学研究的焦点之一是噬脂体对脂滴内脂质代谢的调节上。自噬体作为多功能细胞器,在维持细胞内稳态起着非常重要的作用,它主要起着细胞内“清道夫”作用,可以清理胞质内被分解的蛋白质、衰老的细胞器和进入的病原体等。子宫颈是妊娠期间保胎的门户和分娩时胎儿产出的必经之路,其收缩与开张是主动耗能的过程。子宫颈的关闭与开张是否正常直接影响妊娠和分娩。但是,小鼠子宫颈的能量来源是否与脂滴及自噬体调节有一定的关系,目前鲜有报道。本文为了探索小鼠子宫颈组织中脂滴与自噬体的分布规律及其相关性,分别采集成熟小鼠不同生殖时期的子宫颈,即空怀期、妊娠中期和分娩期三组,每组为50只,用免疫组织化学法(IHC)对组织中LC3和Atg5进行定位,并与油红O染色对LC3和Atg5和脂滴进行复和定位;用Western Blot方法检测组织中抗LC3和Atg5抗体的特异性;用荧光定量RT-PCR方法检测LC3和Atg5及PPARγⅡmRNA的相对表达水平;利用透射电镜观察脂滴和自噬体在子宫颈的分布。结果表明:脂滴和自噬体在成熟小鼠子宫颈的不同时期均存在,并呈现一定的变化规律。利用Image-proplus 6.0软件和IBM SPSS Statistics 19软件对不同时期小鼠子宫颈组织中LC3和Atg5蛋白分布的定量分析显示空怀期、妊娠中期、分娩期小鼠子宫颈中的LC3和Atg5蛋白表达均有极显著差异(P㩳0.01);利用Image J软件和IBM SPSS Statistics 19软件进行单因素方差统计分析Western Blot结果显示空怀期、妊娠中期、分娩期小鼠子宫颈中的Atg5蛋白表达均有极显著差异(P0.01),LC3空怀期与妊娠中期和分娩期有极显著差异(P㩳0.01),妊娠中期与分娩期之间有显著差异(P0.05);脂滴和自噬体蛋白的mRNA表达量妊娠中期最高,其次分娩期,空怀期最低,并且各期之间差异极显著(P0.01)。另外,空怀期脂滴和自噬体较大,但数量相对较少,主要集聚在宫颈腔上皮细胞第一层细胞的细胞核下侧,成簇存在,接触较为松散。在电镜下观察脂滴呈现浅灰或灰白色。妊娠中期脂滴较小,呈现深灰色,主要聚集在腔上皮第一层细胞的腔侧,有的脱离腔上皮,成簇存在,并且数量多于空怀期;分娩期脂滴体积也较小,呈灰色不等,紧密聚集在腔上皮第一层细胞的腔侧。各时期的自噬体与脂滴的表达成正相关。以上这些结果表明,不同生殖时期的子宫颈中的脂滴与自噬体存在着密切关系,脂滴的大小和数量受自噬体的调节。这预示着妊娠期子宫颈的强劲收缩所消耗的能量可能比分娩期子宫颈的急性开张耗能更大,而空怀时期子宫颈耗能最少。自噬体表达的增强可能预示着其在清理更多的来自脂滴的脂肪酸,预防细胞内脂肪酸中毒上起重要作用。
【关键词】：小鼠 子宫颈 自噬体 脂滴 LC3 Atg5 PPARγⅡ
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S865.13
【目录】：
- 符号说明4-7
- 中文摘要7-9
- Abstract9-11
- 1 前言11-19
- 1.1 自噬11-16
- 1.1.1 自噬体的分类11-12
- 1.1.2 自噬体的形成12-13
- 1.1.3 自噬体相关基因与蛋白13-14
- 1.1.4 自噬的适应性反应14-15
- 1.1.5 自噬体与脂滴15-16
- 1.2 脂滴16-18
- 1.2.1 脂滴的结构与功能16-17
- 1.2.2 脂滴相关蛋白17-18
- 1.3 子宫颈18-19
- 2 材料与方法19-38
- 2.1 材料19-22
- 2.1.1 实验动物19
- 2.1.2 主要药品与试剂19
- 2.1.3 主要仪器设备19-20
- 2.1.4 主要试剂配制20-22
- 2.2 试验方法22-38
- 2.2.1 实验动物的饲养管理22-23
- 2.2.2 试验样本的采集23
- 2.2.3 免疫组织化学方法检测LC3和Atg5在小鼠子宫颈组织中的定位23-28
- 2.2.4 蛋白质印迹法检测抗LC3和Atg5抗体在小鼠子宫颈组织中的特异性28-32
- 2.2.5 荧光定量RT-PCR方法检测小鼠子宫颈组织中的LC3、Atg5及PPARγⅡ的相对表达水平32-36
- 2.2.6 子宫颈组织透射电镜观察试验方法36-38
- 3 结果与分析38-50
- 3.1 脂滴、LC3和Atg5蛋白在小鼠子宫颈组织中的分布38-41
- 3.1.1 子宫颈组织中LC3和Atg5的分布38-40
- 3.1.2 子宫颈组织中脂滴与LC3和Atg5的分布及其关系40-41
- 3.2 蛋白质印迹法检测抗LC3和Atg5抗体在小鼠子宫颈组织中的特异性41-42
- 3.3 小鼠子宫颈组织的荧光定量RT-PCR检测结果42-48
- 3.3.1 组织样本总RNA提取的完整性与纯度以及荧光定量RT-PCR的重复性42-43
- 3.3.2 RT-PCR得到的扩增产物的特异性43
- 3.3.3 RT-PCR扩增LC3、Atg5和PPARγⅡ基因片段产物的扩增曲线、熔解曲线及扩增效率曲线43-45
- 3.3.4 RT-PCR检测目的基因的表达效果45-48
- 3.4 小鼠子宫颈组织透射电镜观察结果48-50
- 4 讨论50-52
- 5 结论52-53
- 参考文献53-60
- 致谢60-61
- 作者简介及发表论文情况61
【参考文献】
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，本文编号：924823
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