莱茵衣藻MYB、AP2基因干涉对油脂含量的影响及其启动子区甲基化初步分析

发布时间：2017-09-27 03:45

  本文关键词：莱茵衣藻MYB、AP2基因干涉对油脂含量的影响及其启动子区甲基化初步分析

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【摘要】：微藻是具有生长繁殖快、培养技术简单、含油量高等优势的一种微型生物,开发微藻对于生物新能源的获取提供了良好的材料。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种模式生物,其基因组测序已经全部完成,因此为莱茵衣藻的基因功能研究奠定了物质基础。本试验通过对莱茵衣藻基因组基因进行干涉从而筛选出和油脂产量相关的基因。首先通过高通量转录组测序法对莱茵衣藻CC124在正常(TAP)与氮饥饿(TAP-N)条件下培养24h的全基因组进行表达差异分析,结果显示,在氮饥饿培养条件下,有4493个基因表达上调,其中CrMYB7、Cr MYB8、CrAP2-3、CrAP2-4四个基因表达上调显著。因此,对具有MYB结构域的CrMYB7和CrMYB8及AP2结构域CrAP2-3和CrAP2-4四个基因在油脂代谢途径中功能进行了研究。PCR获得CrMYB7、CrMYB8、CrAP2-3、CrAP2-4四个基因的干涉片段,构建各基因的干涉表达载体,用玻璃珠转化法将干涉载体转入莱茵衣藻CC425中。采用荧光定量PCR方法对干涉后的莱茵衣藻进行检测,发现被干涉的基因表达量显著降低,确定干涉成功,然后进行中性脂测定。运用尼罗红快速染色测定法测定培养6天的转化藻株的中性油脂含量,发现CrMYB7-RNAi、CrAP2-4-RNAi两转化藻株的中性油脂含量降低20%左右。将这两株进行1-7天油脂积累,生物量测定,发现转化藻株比野生型藻株生长缓慢,但到对数期生物量大小基本一致。将转化藻株与野生型藻株进行总脂含量的测定,发现CrMYB7-RNAi和CrAP2-4-RNAi比野生型藻株总脂含量下降12%-18%。为验证氮饥饿下CrMYB7和CrAP2-4基因表达量升高是否与基因的甲基化相关,本论文研究了莱茵衣藻CC124野生型藻株启动子区域甲基化情况,通过重亚硫酸盐测序法测定CC124在正常条件及减氮条件下启动子区域甲基化位点。结果表明:在正常培养条件下CrAP2-4启动子区域200bp内出现一个可能存在的甲基化位点,而在氮饥饿情况下没能预测出甲基化位点。因此,启动子的去甲基化可能导致了氮饥饿条件下CrAP2-4基因的表达量升高。
【关键词】：莱茵衣藻 中性油 氮饥 RNA 甲基 重亚硫酸盐测序
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-25
• 1.1 微藻产油的研究背景9
• 1.2 微藻是新能源开发的理想生物材料9-15
• 1.2.1 微藻生物柴油的研究现状9-10
• 1.2.2 影响微藻生长和油脂积累的因素10-13
• 1.2.3 微藻的总油脂及提取方法13
• 1.2.4 微藻三酰甘油代谢的过程13-15
• 1.3 莱茵衣藻的概述15-17
• 1.3.1 莱茵衣藻的分类地位及其细胞结构15-16
• 1.3.2 莱茵衣藻的生活史16
• 1.3.3 选择莱茵衣藻作为研究对象的优势16-17
• 1.4 基因组基因突变技术17-18
• 1.4.1 基因敲除和敲入技术17
• 1.4.2 反义技术17
• 1.4.3 RNA干扰技术17-18
• 1.5 MYB家族转录因子18-21
• 1.5.1 MYB家族转录因子的结构特征19
• 1.5.2 MYB转录因子的作用19-21
• 1.6 AP2基因家族转录因子21
• 1.7 表观遗传学（Epigenetics）21-23
• 1.7.1 DNA甲基化及其原理22
• 1.7.2 植物DNA甲基化途径22-23
• 1.7.3 DNA甲基化检测方法23
• 1.8 本实验的目的及意义23-25
• 第二章 莱茵衣藻MYB与AP2基因的RNA干涉研究25-51
• 2.1 实验材料25-28
• 2.1.1 实验所用藻株及其它菌株25
• 2.1.2 构建干涉所用的载体25
• 2.1.3 实验所需仪器、试剂及试剂盒25-26
• 2.1.5 实验所需要的培养基26-27
• 2.1.6 实验所用的引物27-28
• 2.2 实验方法28-36
• 2.2.1 莱茵衣藻CC425培养条件28
• 2.2.2 莱茵衣藻CC425总RNA的提取28-29
• 2.2.3 莱茵衣藻RNA反转录成cDNA29
• 2.2.4 莱茵衣藻转录组测序29
• 2.2.5 干涉片段克隆及测序29-31
• 2.2.6 用于构建RNAi干涉载体的反向重复片段的获得31-32
• 2.2.7 RNAi载体的构建32-33
• 2.2.8 干涉藻株的生物量检测33-35
• 2.2.9 qRT-PCR检测转基因藻株mRNA水平35-36
• 2.2.10 qRT-PCR检测转基因藻株对与中性油脂合成相关基因的影响36
• 2.3 实验结果36-51
• 2.3.1 莱茵衣藻CC124正常条件与减氮条件下的转录组测序结果36-37
• 2.3.2 qRT-PCR检测CrMYB7、CrMYB8、CrAP2-3、CrAP2-4 的基因表达丰度37-39
• 2.3.3 干涉片段的PCR克隆测序及T282中间载体的构建39-40
• 2.3.4 RNAi载体酶切验证40-41
• 2.3.5 RNAi转化莱茵衣藻CC425转化子的筛选41-42
• 2.3.6 莱茵衣藻CC425干涉藻株油脂含量及生物量的检测42-51
• 第三章 CrAP2-4 与CrMYB7启动子区域甲基化水平分析51-57
• 3.1 实验材料51
• 3.1.1 实验所需藻种51
• 3.1.2 实验所需仪器51
• 3.1.3 实验所需试剂及试剂盒51
• 3.1.4 实验所需培养51
• 3.1.5 实验中引物的设计51
• 3.2 实验方法51-53
• 3.2.1 藻株的培养51
• 3.2.2 莱茵衣藻CC124的DNA的提取51-52
• 3.2.3 DNA重亚硫酸盐处理52-53
• 3.2.4 以重亚硫酸盐处理的DNA模板进行PCR扩增53
• 3.2.5 PCR扩增产物的测序53
• 3.2.6 测序结果的比对53
• 3.3 实验结果与分析53-57
• 3.3.1 重亚硫酸盐处理结果比对53-54
• 3.3.2 测序结果甲基化位点的预测54-57
• 第四章 讨论57-61
• 4.1 莱茵衣藻57
• 4.3 MYB、AP2转录因子57-58
• 4.4 CrMYB7和CrAP2-4 对莱茵衣藻油脂积累的影响58
• 4.5 DNA甲基化58-61
• 第五章 结论61-63
• 参考文献63-71
• 致谢71-73
• 个人简历73

【参考文献】

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本文编号：927446