GAB2基因非编码功能的研究与特征描述

发布时间：2017-09-27 20:32

  本文关键词：GAB2基因非编码功能的研究与特征描述

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【摘要】：目的：构建含Gab2基因CDS片段,FL片段以及FLM表达载体并探究Gab2基因是否具有non-coding功能。方法：构建CDS,FL和FLM基因表达载体,然后构建瞬转乳腺癌细胞系和结肠癌细胞系,通过western blot检测瞬转细胞系中相关蛋白分子的表达情况,再通过各种细胞功能实验检测,对比转入三种质粒载体后的细胞功能差异,以及用Q-PCR检测下游基因表达情况的差异,从而作出Gab2基因CDS区域以及其真正全长FL的比较,推测Gab2基因除了coding功能外是否还具有一定的non-coding功能。结果：成功构建出了Gab2基因的CDS,FL,FLM表达载体,并构建了相应的瞬转细胞用于功能实验和实时定量PCR检测,在功能实验的各项指标以及Real-time PCR的检测结果中都显示着Gab2基因的CDS片段功能与其全长FL有一定的相似性,但也存在着很大的差异,甚至有很多相反的情况出现。结论：Gab2基因的功能可能并不仅仅取决于其CDS区域,其非编码区可能也发挥着很重要的功能,致使整个基因的功能与由其编码区域单独的功能有很多的差异,因此即使是对于所熟识的coding基因,也应当从整体来看待一个基因的功能,而不是只着重于转录翻译的CDS区。
【关键词】：编码基因 非编码基因 GAB2基因 编码区域 基因
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
【目录】：

• 致谢5-9
• 中文内容摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 第一章 背景11-17
• 1.1 Gab2基因和Gab2蛋白概述11-13
• 1.1.1 Gab2基因及其表达蛋白综述11
• 1.1.2 Gab2介导的信号转导机制11-12
• 1.1.3 Gab2与乳腺癌的关系12-13
• 1.1.4 Gab2与结肠癌的关系13
• 1.2 基因组成概述13-15
• 1.2.1 3'UTR片段的位置13
• 1.2.2 3'UTR片段与microRNA的关系13-14
• 1.2.3 Coding Sequence(CDS)区域概述14-15
• 1.2.4 Mutation对基因表达的影响15
• 1.3 non-coding基因及non-coding功能简介15-16
• 1.4 MCF-7细胞概述16
• 1.5 HCT116细胞概述16-17
• 第二章 实验过与方法17-39
• 2.1 构建Gab2基因片段表达载体17-22
• 2.1.1 实验材料17
• 2.1.2 CDS和full-length(FL)片段的扩增17-19
• 2.1.3 mutation(FLM)的构建19
• 2.1.4 制备感受态细菌19-20
• 2.1.5 CDS,FL以及FLM片段重组质粒的构建20-22
• 2.2 构建空质粒载体(VEC),CDS,FL和FLM瞬转细胞系22-26
• 2.2.1 实验材料22-23
• 2.2.2 重组质粒的中量抽取23-24
• 2.2.3 细胞培养及转染24-26
• 2.3 瞬转细胞系中基因表达情况的检测26-30
• 2.3.1 实验材料26
• 2.3.2 Total RNA的抽取26-27
• 2.3.3 miRNA的抽取27
• 2.3.4 逆转录27-28
• 2.3.5 实时定量荧光PCR(Real-time PCR)28
• 2.3.6 Western Blot检测细胞内蛋白表达情况28-30
• 2.4 内源性GAB2基因敲除细胞系的建立30-31
• 2.4.1 实验材料30
• 2.4.2 细胞培养及转染siRNA30-31
• 2.4.3 敲除效果测定31
• 2.5 体外瞬转细胞功能检测31-35
• 2.5.1 Soft Agar检测细胞活性31-32
• 2.5.2 MTT Assay检测细胞存活能力32-33
• 2.5.3 Transwell Assay检测细胞转移侵袭能力33-35
• 2.6 回补实验检测细胞功能的区别35-37
• 2.6.1 实验材料35
• 2.6.2 共转质粒和siRNA35-36
• 2.6.3 Transwell实验检测回补效果36
• 2.6.4 平板克隆形成实验检测回补效果36-37
• 2.7 RNA-seq检测瞬转细胞系中mRNA的表达变化37-38
• 2.7.1 实验材料37
• 2.7.2 实验原理37
• 2.7.3 实验目的37
• 2.7.4 实验方法37
• 2.7.5 细胞系中的验证37-38
• 2.8 临床样品的检测38-39
• 2.8.1 临床样品的收集38
• 2.8.2 临床样品提取total RNA38
• 2.8.3 total RNA逆转录cDNA38
• 2.8.4 实时定量荧光PCR检测38-39
• 第三章 细胞功能实验结果与讨论39-53
• 3.1 克隆相关的结果39-41
• 3.1.1 pcDNA3.1示意图39-40
• 3.1.2 克隆载体构建结果40-41
• 3.2 实时定量荧光PCR结果41-42
• 3.2.1 各细胞系GAB2基因表达情况检测41
• 3.2.2 顺转细胞系GAB2基因表达情况检测41-42
• 3.3 Western Blot测量细胞中Gab2蛋白表达量的结果42-43
• 3.4 Soft Agar实验结果43-46
• 3.5 MTT实验结果46-47
• 3.6 Transwell实验结果47-49
• 3.7 GAB2基因敲除结果49-51
• 3.7.1 Real-time PCR检测敲除效率49-50
• 3.7.2 基因敲除后细胞功能实验结果50-51
• 3.8 回补实验结果51
• 3.9 细胞功能实验总结51-53
• 第四章 RNA-seq结果与验证53-59
• 4.1 RNA-seq检测结果53-54
• 4.2 RNA-seq变化基因统计54-55
• 4.3 调控基因在细胞系中的验证55-56
• 4.4 临床样品验证结果56-59
• 第五章 总结与讨论59-63
• 5.1 过往的认知59-60
• 5.2 对权威的疑惑60
• 5.3 编码基因和非编码基因的真正区别60-62
• 5.4 对未来工作的展望62-63
• 附录63-69
• 参考文献69-72

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