牙周膜细胞内miRNA-23a,30a发挥调控作用的靶基因筛选

发布时间：2017-09-28 12:34

  本文关键词：牙周膜细胞内miRNA-23a,30a发挥调控作用的靶基因筛选

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【摘要】：牙周炎是慢性炎症导致的骨吸收病变,具有很大的危害性。现在治疗牙周炎的常规方式为基础治疗,药物治疗以及手术治疗等,但理想的牙周骨组织再生修复效果却难以达到。成骨细胞和破骨细胞协同完成维持了骨代谢的平衡。而成骨相关细胞在炎性环境下生成受抑,基质分泌矿化受阻则是造成牙周炎性骨代谢失衡的关键原因。细胞成骨分化可由多种炎症因子通过不同的信号通路调控,这一点已由大量研究证实。miRNA在这类炎症因子中占有重要的一部分。miRNA的发现使人们将注意力将人们将注意力放到转录后水平的调节上。miRNAs是一类非编RNA,长度约22nt,进化上高度保守,参与转录后水平的基因调控,紧密参与了生理过程中和某些疾病产生进程内的调节与控制。相关研究认为,牙周炎的发生与某些miRNAs表达改变有关。到现在为止,国内外学者研究了一群特定的miRNAs,但是对共同调节着牙周炎和骨分化的分子:miR-23a和miR-30a以及它们对牙周炎性骨缺失发生机制的研究相对较少。同时,基因芯片分析技术发展起来,此技术是基于过表达或沉默miRNA后,通过检测基因表达水平变化来筛选判断miRNA靶基因。基于以上研究背景,本实验即通过计算机生物信息学软件miRanda,Target Scan和Pic Tar预测miR-23a和miR-30a可能的靶基因,继而体外干预炎症牙周膜细胞内miR-23a和miR-30a的表达水平,检测已经预测到的可能靶基因的表达情况,从而筛选出在牙周膜细胞中,miR-23a和miR-30a发挥调控作用的靶基因。研究目的(1)确定候选靶基因。(2)从候选靶基因中筛选鉴定出miR-23a的靶基因并验证。(3)从候选靶基因中筛选鉴定出miR-30a的靶基因并验证。研究方法(1)miRanda[53](http://www.microma.org),Target Scan[54](http://www.targetscan.org)和Pic Tar[55](http://pictar.bio.nyu.edu/)三个数据库对miRN As的靶基因进行生物预测,取三个软件预测的靶基因的交集,确定分值较高的作为候选靶基因。(2)通过体外转染miR-23a的mimics和inhibitor,实现miR-23a的过表达和低表达。用Real-time PCR以及Western-Blot(免疫印迹法)检测相关基因和蛋白的表达水平。(3)通过体外转染miR-30a的mimics和inhibitor,实现miR-30a的过表达和低表达。用Real-time PCR以及Western-Blot(免疫印迹法)检测相关基因和蛋白的表达水平。实验结果(1)最终圈定CAMTA1,CNTTBIP,PPPAR,Runx2,STAT1,SATB1以及STAT5B为miR-23a和miR-30a的候选靶基因。(2)升高miR-23a的表达之后,Real-time PCR以及Western-Blot检测相关基因STAT5B及蛋白的表达下降,相反,抑制miR-23a的表达后,Real-time PCR以及Western-Blot检测基因STAT5B及蛋白的表达上升。由此可确定STAT5B为miR-23a的靶基因,其他候选靶基因结果为阴性,被排除。(3)升高miR-30a的表达之后,Real-time PCR以及Western-Blot检测相关基因Runx2及蛋白的表达下降,相反,抑制miR-30a的表达后,Real-time PCR以及Western-Blot检测基因Runx2及蛋白的表达上升。由此可确定Runx2为miR-30a的靶基因,其他候选靶基因结果为阴性,被排除。结论(1)miR-23a和miR-30a参与调控炎性微环境下牙周膜细胞的生物学活性。(2)升高miR-23a和miR-30a的表达可抑制牙周膜细胞成骨作用。
【关键词】：靶基因 miRNA 炎症
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.4
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 文献回顾12-30
• 实验一 生物信息学软件预测miR-23a和miR-30a可能靶基因30-35
• 1 材料30
• 2 方法30-31
• 3 结果31-32
• 4 讨论32-35
• 实验二 mRNA水平牙周膜细胞中miR-23a和miR-30a靶基因的筛选35-48
• 1 材料35-36
• 2 方法36-41
• 3 结果41-45
• 4 讨论45-48
• 实验三 蛋白水平牙周膜细胞中miR-23a和miR-30a靶基因的验证48-54
• 1 材料48-49
• 2 方法49-52
• 3 结果52
• 4 讨论52-54
• 小结54-56
• 参考文献56-62
• 个人简历和研究成果62-63
• 致谢63

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1 毛钊;影响牙周膜细胞生物学功能的相关因素[J];医学研究生学报;2003年06期

2 凌均h，

本文编号：935886