β-木糖苷酶基因的克隆与重组表达及其酶学性质研究

发布时间：2017-10-02 12:16

  本文关键词：β-木糖苷酶基因的克隆与重组表达及其酶学性质研究

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【摘要】：木聚糖类半纤维素是一类极为丰富的自然资源,在造纸、纺织及农业废弃物中广泛存在,其水解产物可作为碳源生产各种发酵产物。木聚糖酶可水解木聚糖为低聚木糖,而水解低聚木糖为木糖的p-木糖苷酶是发酵利用木聚糖类半纤维素的限速酶。p-木糖苷酶的研究主要集中在国外,国内研究相对较少。本文对一株黑曲霉菌株的p-木糖苷酶基因进行克隆、异源表达与初步的酶学性质研究。本文根据已报道的黑曲霉β-木糖苷基因序列为参照,通过同源比对,找出保守序列,设计特异性引物,以一株黑曲霉为材料,PCR扩增获得目的基因；克隆得到的β-木糖苷酶基因序列全长2415 bp,其DNA序列与已知的黑曲霉β-木糖苷酶基因相似度为97%,氨基酸序列相似度为99%；预测其78个碱基序列为信号肽,预测等电点为4.73。分别以pET32a和pPICZaA构建表达载体,采用大肠杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统进行异源表达。目的基因在pET32a表达载体中表达的蛋白为包涵体,在pPICZaA表达载体中表达时发酵液及菌体中均检测到酶活。对重组pPICZaA载体中表达的单克隆菌株进行筛选,筛选出一株高酶活菌株pPICZaA-xyD11,对该菌株诱导4天的发酵液酶活测定,酶活达到5.723 U/mL。对该菌株的表达条件进行优化,按接种量OD6000.4-0.5接种于体积分数占总体积的20%的培养瓶中,以1.5%甲醇进行诱导4-5 d后酶活达到最高,诱导过程中添加EDTA及油酸会降低酶活,添加体积分数为0.3%的Tween-80可以提高酶活。对诱导表达的蛋白进行了初步的纯化。本实验为该黑曲霉菌株中p-木糖苷酶基因的蛋白表达、酶学性质及应用奠定了基础。
【关键词】：黑曲霉 β-木糖苷酶 基因克隆 表达
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q55
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-21
• 1 本课题的研究背景11-19
• 1.1 β-木糖苷酶的简介11
• 1.2 β-木糖苷酶的来源11-12
• 1.3 β-木糖苷酶的分类12
• 1.4 β-木糖苷酶的结构12-13
• 1.5 β-木糖苷酶昀催化机制13
• 1.6 β-木糖苷酶的分离纯化13-14
• 1.7 β-木糖苷酶的活性检测14
• 1.8 β-木糖苷酶的酶学性质14-15
• 1.9 β-木糖苷酶基因克隆的研究进展15-16
• 1.10 β-木糖苷酶基因的克隆方法16-17
• 1.11 β-木糖苷酶的应用17-19
• 2. 研究的思路及意义19-21
• 2.1 研究思路19-20
• 2.2 研究意义20-21
• 第二章 目的基因的克隆21-32
• 1 实验材料21-23
• 1.1 供试菌株与质粒21-22
• 1.2 实验仪器22-23
• 1.3 试剂与酶23
• 1.4 试剂配制23
• 2 试验方法23-28
• 2.1 引物设计23-24
• 2.2 基因组提取24-26
• 2.3 PCR产物纯化26
• 2.4 目的基因的克隆26-27
• 2.5 测序结果分析27-28
• 3 结果与分析28-30
• 3.1 黑曲霉基因组的提取结果28
• 3.2 目的基因扩增结果28-29
• 3.3 目的基因的克隆及测序验证结果29
• 3.4 测序结果及分析29-30
• 4 本章小结30-32
• 第三章 β-木糖苷酶基因的原核表达32-40
• 1 实验材料33
• 2 试验方法33-36
• 2.1 引物设计33
• 2.2 克隆质粒及表达质粒pET32a的提取33-34
• 2.3 目的基因的PCR扩增34
• 2.4 载体及目的基因的双酶切及胶回收34
• 2.5 酶切片段的连接34-35
• 2.6 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞35
• 2.7 重组质粒的验证35-36
• 2.8 重组质粒电转E.coli BL2I(DE3)感受态细胞36
• 2.9 蛋白在E.coli BL21中的表达36
• 3 结果与分析36-39
• 3.1 目的基因的PCR结果36-37
• 3.2 质粒及目的基因双酶切结果37
• 3.3 重组质粒的验证结果37-38
• 3.4 蛋白在E.coli BL21中的表达结果38-39
• 4 本章小结39-40
• 第四章 β-木糖苷酶基因的真核表达40-64
• 1 实验材料41
• 2 实验方法41-50
• 2.1 引物的设计41-42
• 2.2 克隆质粒及表达质粒pPICZαA的提取42
• 2.3 目的基因的PCR扩增42
• 2.4 载体及目的基因的双酶切及胶回收42-43
• 2.5 酶切片段的连接及转化43
• 2.6 重组子的鉴定43
• 2.7 重组子的线性化43-44
• 2.8 酵母感受态细胞制备44
• 2.9 重组表达载体的转化44-45
• 2.10 重组毕赤酵母菌株的PCR快速鉴定45
• 2.11 重组酵母菌株的诱导表达45-46
• 2.12 酶活检测46-47
• 2.13 高酶活菌株筛选47
• 2.14 表达条件优化47-50
• 2.15 蛋白纯化50
• 3 结果与分析50-63
• 3.1 目的基因的扩增结果50
• 3.2 目的基因及质粒pPICZαA载体的双酶切结果50-51
• 3.3 重组子的鉴定结果51-52
• 3.4 重组质粒的线性化结果52
• 3.5 重组酵母的PCR快速鉴定结果52-53
• 3.6 酶活检测结果53
• 3.7 高酶活菌株的筛选结果53-54
• 3.8 表达条件优化结果54-62
• 3.9 蛋白纯化结果62-63
• 4 本章小结63-64
• 第五章 结论与讨论64-66
• 1 总结64
• 2 创新点64-65
• 3 展望65-66
• 附录66-69
• 参考文献69-77
• 致谢77

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本文编号：959554